单纯疱疹病毒1型ICP0真核载体构建及其对巨噬细胞分泌活性影响.pdfVIP

单纯疱疹病毒1 型ICP0 蛋白真核表达载体 的构建及其对巨噬细胞分泌活性的影响 研究生：黄靓 导师：谭立志 教授 中 文 摘 要 目的：构建ICP0真核表达载体pEGFP/ICP0 ，转染巨噬细胞，检测ICP0在巨噬细 胞中的表达与定位。研究GFP-ICP0融合蛋白瞬时高表达对激活巨噬细胞分泌IL - 1β 、TNF-α 以及NO 的影响，为进一步探讨ICP0 的致病性提供一定的实验依据。 方法：限制性内切酶双酶切质粒 PT7-110，将目的基因连接至真核表达载体 pEGFP －C1，构建ICP0 真核表达载体 pEGFP/ICP0 。转染至巨噬细胞后，荧光 显微镜观察ICP0 在巨噬细胞中的定位，western blotting 检测ICP0 蛋白的表达。 用TNF- α和IL-1 β定量试剂盒检测LPS 激活的巨噬细胞分泌TNF-α 和IL-1β 的 水平，用Griess 试剂测定经刺激后的小鼠巨噬细胞产生的NO 水平。 结果：限制性内切酶双酶切质粒 PT7-110，将该目的片断亚克隆至真核载体 pEGFP-C1 上，所构建的真核表达载体pEGFP/ICP0 转染巨噬细胞，荧光显微镜 观察 GFP-ICP0 融合蛋白定位于细胞核，western blotting 结果表明pEGFP/ICP0 可以在真核细胞中表达大小约为 107KD 的GFP-ICP0 融合蛋白。转染24h 后的 细胞加入终浓度为100ng/mL 的LPS 诱导，分别收集诱导后12h、24h、48h 细胞 培养上清，ELISA 法检测上清中细胞因子TNF-α、IL-1β 含量的变化，Griess 试 剂测定上清液中的NO 水平。结果表明，GFP-ICP0 融合蛋白瞬时表达可上调LPS 诱导的巨噬细胞细胞因子TNF-α、IL-1β 以及NO 的分泌，与各对照组比较，结 果有显著性差异 （采用方差分析，P0.05）。 4 结论： 1.成功构建了pEGFP/ICP0 真核表达载体，GFP-ICP0 融合蛋白成功表达 并定位于细胞核； 2.GFP-ICP0 融合蛋白瞬时表达上调 LPS 诱导巨噬细胞分泌细胞因子 TNF-α、IL-1β； 3.GFP-ICP0 融合蛋白瞬时表达上调LPS 诱导巨噬细胞分泌NO 。 关键词：单纯疱疹病毒1 型；GFP-ICP0 ；巨噬细胞；细胞因子；NO 基金项目：湖南省教育厅资助项目（NO.02c391 ） 5 Construction of the herpes simplex virus 1 ICP0 eukaryotic expression vector and its effects of macrophage secrete activity ABSTRACT Objectives: To construct the eukaryotic expression vector of herpes simplex virus 1 ICP0(HSV-1 ICP0) and test its expression in macrophage cells. Then study the effects of GFP-ICP0 on LPS induced chang of macrophage secrete activity. Methods: Restriction enzyme digest PT7-110 , the fragment of ICP0 was subcloned into eukaryotic expression vector pEGFP-C1 ，then the recombined vector pEGFP/ICP0 was transfected into macrophage. The expression of GFP-ICP0 was analy