Preparation and in vitro characterization of folate modified novel stealth vesicles叶酸修饰的新型隐形泡囊的制备及其体外性质研究.pdfVIP

叶酸修饰的新型隐形泡囊的制备及其体外性质研究 中文摘要 目的：泡囊稳定性高，生物相容性好，毒性低，表面可进行靶向性修饰，包载抗 癌药后可高效低毒治疗癌症。利用泡囊的这些特点，结合叶酸主动靶向给药系统对癌 细胞表面过度表达叶酸受体的特异性作用，可定向传输药物至癌细胞发挥药效，本文 采用自制载体材料，分别以亲水性药物去甲斑蝥素与亲脂性药物脱盐阿霉素为模型药 物，制备叶酸修饰隐形泡囊（Fa-nios ），并对其包裹不同性质药物的理化特性及体外 药效学进行评价。 方法：（1）合成泊洛沙姆 P407-胆固醇（P407-Chol ）与叶酸-PEG4000-胆固醇 （Fa-PEG-Chol ）作载体材料，并经红外光谱、X-射线、差示热分析、核磁共振等方 法，表征它们的结构及其反应效率；通过溶血性试验验证其安全性；（2 ）以去甲斑蝥 素或阿霉素为模型药物，用上述载体材料以改良注入法制备叶酸泡囊，以单因素考察 法优化泡囊的处方及其制备工艺（用包封率和粒径作为评价指标）；（3 ）通过透射电 镜观察、测定粒径、粒径分布、表面水化层厚度、包封率等，表征叶酸泡囊，并在模 拟癌细胞环境（pH 5.0 ）和正常细胞环境（pH 7.4 ）下，以透析法考察叶酸泡囊的体 外释放特性；（4 ）为考察叶酸泡囊的抗癌作用特性，以叶酸受体过度表达的人源性宫 颈癌细胞 Hela 细胞为体外肿瘤细胞模型，采用细胞摄取定量测定实验考察叶酸泡囊 对于 Hela 细胞的主动靶向性，并使用流式细胞凋亡术研究叶酸泡囊导致细胞坏死的 途径，进一步采用细胞毒性试验（MTT 法）考察细胞毒性。（5 ）为考察叶酸泡囊的 抗癌作用机理，掌握其进入细胞的过程，以 Hela 细胞为模型，使用流式细胞术定量 定性的考察包裹两种不同性质药物的泡囊对于 Hela 细胞的亲和性，并通过考察叶酸 泡囊内吞蛋白抑制剂、温度、药物浓度作用时间等对进入癌细胞药量的影响，并以荧 光显微镜适时观察作用过程，评价叶酸泡囊的细胞吸收情况。 结果：（1）合成的泊洛沙姆 P407-胆固醇和叶酸-PEG4000-胆固醇的结构均得到 红外，1HNMR 等的证实，溶血性试验结果无溶血现象，证实较为安全。（2 ）通过单 因素考察实验，筛选出最优处方和工艺的叶酸修饰去甲斑蝥素隐形泡囊和叶酸修饰阿 I 霉素隐形泡囊；（3 ）叶酸修饰去甲斑蝥素隐形泡囊和叶酸修饰阿霉素隐形泡囊的粒径 分别为（100.87±0.23）nm 和 （211.25 ±8.75 ）nm ；表面水化层厚度为 1.63nm 和 1.72nm， 可推测叶酸泡囊能规避吞噬，能满足体内长循环要求；包封率分别为（52.3±2.16 ） %和（96.41±2.65 ）% ；多分散指数PDI 分别为 0.176 和 0.253 。透射电镜显示叶酸 泡囊外观圆整，粒径大小均匀。叶酸泡囊的体外释放速率显著低于游离药物（P0.01 ）， 且在正常细胞环境的释放速率显著小于癌细胞环境（P0.01 ）。（4 ）细胞摄取定量试 验均表明：4h 时叶酸泡囊对Hela 细胞的亲和力比无Fa 的隐形泡囊更为显著（P0.01 ）。 流式细胞凋亡试验说明，凋亡是去甲斑蝥素导致细胞坏死的途径之一，且制成叶酸泡 囊后并未改变此种途径。细胞毒性试验结果，分别呈现毒性对作用时间和药物浓度的 依赖性，且毒性大小次序为：叶酸泡囊 隐形泡囊游离药物，空白泡囊几乎无毒。（5 ） 流式细胞摄取试验(FCM)证明了叶酸泡囊的靶向性。内吞蛋白抑制剂试验表明：网格 蛋白抑制剂氯丙嗪可有效抑制 Hela 细胞对药物的摄取。Hela 细胞摄取试验表明：摄 取环境温度、药物浓度、作用时间均会对摄取叶酸泡囊的量产生影响。荧光显微镜观 察结果说明：当药物用叶酸泡囊包载后更易进入肿瘤细胞及其