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        Adeno-Associated Viral Vector  研究级腺相关病毒载体  生产流程和使用说明                        和元生物技术(上海)有限公司  2013年2月     目  录    腺相关病毒的运输和储存1  生产流程和使用说明  2  腺相关病毒载体概述 5  腺相关病毒用于基因传递和表达的优势 7  腺相关病毒颗粒生产包装9  AAV 重组质粒构建和抽提  11   AAV‐293 细胞培养 12  AAV‐293 细胞说明 12  培养要点  12  冻存 AAV‐293 细胞的复苏  12   AAV‐293细胞的传代13   AAV‐293细胞液氮冻存  14   AAV 病毒的出毒包装  15  准备 AAV‐293 细胞 15   AAV‐293 细胞的转染15  观察出毒 16  收毒  17  AAV 病毒的浓缩 17   AAV的纯化  17  超滤脱盐 17  病毒的保存 17  病毒滴度的测定  17  所用试剂、仪器列表和试剂配方20                    腺相关病毒的运输和储存   病毒采用低温运用，在泡沫盒中放置一定数量的低温冰袋达到保温的效果，一般情况下， 病毒能在发出后 2-3天送达目的地。因为干冰运送被发现有损病毒滴度，而且腺相关病毒 的稳定性极好，所以我们都采用上述方式运送。如果收到病毒时，病毒已解冻为正常现象。   请在病毒收到后放入-80℃作长期保存。如果病毒原液滴度过高，可以用含5%甘油的  PBS稀释分装。   避免反复冻融，视实验需要，将病毒分为若干份，可以有效降低反复冻融的问题。 避 免蛋白酶等污染，腺相关病毒为蛋白外壳的病毒载体，蛋白酶会降解它导致其失效。   避免细菌等其他污染，我们所提供的腺相关病毒可以已经过多次 0.22μm的滤器过滤， 可以保证产品的无污染状态。特别是细胞实验时，需要保持其清洁，以免污染细胞。当同一 种病毒即要用于细胞实验和动物实验时，建议将两种病毒分开放置，以免发生交叉污染。   收到货物时，如遇到包装破损等问题，请及时与我们的工作人员联系。     实验室环境和安全要求   注意：以下的说明和要求并非要替代使用者实验室高于 BSL 2等级操作规程和要求，而是对现有实验体系 的一种补充，如果使用者实验室未能达到 BSL 2实验条件，那么请认真阅读以下内容。   在使用腺相关病毒前，使用者应当对腺相关病毒载体的安全问题有充分的了解。虽然腺 相关病毒比腺病毒或是慢病毒的安全性更高，并且野生型的腺相关病毒在人群中的广泛分布， 但考虑到其病毒的天然属性而且我们制备的腺相关病毒滴度比自然环境中的要高许多个数 量级，使用者在操作中保持一定的警惕性也是相当有必要的。   实验室操作要求   1      我们生产腺相关病毒是按照 NIH Biosafety Level 2的要求进行的。但实际上 AAV是 被归为 Biosafety Level 1 (BSL-1)病毒, 特别是现在采用的无辅助病毒的包装方法生产的  AAV 载体并不会增加其生物危害性，不过插入基因的性