流式细胞术应用.pptxVIP

三、流式细胞术的应用;3.1 检测细胞周期 3.2 检测细胞凋亡 3.3 检测细胞增殖 3.4 免疫细胞亚型检测 3.5 检测细胞因子 3.6 检测细胞吞噬功能 3.7 干细胞研究 3.8 检测基因表达;3.1 检测细胞周期;细胞周期分析核酸染料 细胞膜非通透性染料：PI(碘化丙啶)、EB(溴化乙啶)，不能进入完整细胞膜，标记时需要通过固定等方法增加细胞膜的通透性。 细胞膜通透性染料：DAPI、Hoechst，能染活细胞的DNA，但需紫外激光激发。 PI标记法检测细胞周期 需要乙醇固定增加细胞膜的通透性； 需要加RNase，去除RNA对DNA的干扰。;PI法检测细胞周期一般步骤： 收集单细胞悬液(1 ×106个)，缓慢加入1 ml预冷的70％乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定。 离心收集细胞，再以1ml PBS彻底洗去乙醇； 去上清后加入染色液(包含50ug/ml PI，100ug/ml RNase A，0.2% Triton X-100)，37 ℃ 染色30min后上机检测。;细胞周期检测结果;DNA倍体分析;Porcoll分离纯化精子单倍体细胞;双联体细胞的去除 利用信号脉冲FL2-W/FL2-A区别标本中的粘连细胞以及碎片，最大程度的减少假阳性。 ;3.2 检测细胞凋亡;3.2.1 亚二倍体(Sub-G1)峰的检测;3.2.2 Annexin V/PI双染法;PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以PI不能进入早期凋亡细胞核内。;免疫荧光图;ALA光敏剂(1mM/M)HL60 氦氖激光(18mj/cm2);3.2.3 线粒体膜电位检测法;3.2.4 活化的caspase-3检测法;Jurkat T-Cells Mouse Thymocytes;3.2.5 DNA断裂片段的检测(TUNNEL法);TUNEL法检测凋亡原理;Fas-induced Apoptosis in Jurkat T Cells;3.3 检测细胞增殖;3.3.1 示踪染料标记法;PMA刺激小鼠的脾细胞增殖图;3.3.2 BrdU标记法;BrdU标记时同时加入DNA染料(PI, 7-AAD)，结果为一个典型的“马蹄形”峰，不仅能得到G0/G1期、S期和G2/M期的比例，还能比较不同细胞DNA合成能力的不同。;BrdU标记法不仅适用于体外培养细胞，还适用于检测体内目标细胞的增殖，一般将BrdU掺入小鼠的饮用水或者腹腔注射，经过一段时间后取出目标细胞进行检测。 注意：BrdU掺入的时间对结果影响很大。;BrdU标记法检测细胞增殖的另一优势是：发挥流式多参数的特性，能和其他指标同时检测，既可以是表面抗原，也可以是胞内蛋白。;3.3.3 增殖蛋白检测;3.4 免疫细胞亚型检测;细胞群体;Granulocytes;3.4.1 淋巴细胞亚群分析;FSC;T细胞、B细胞和NK细胞比例检测;3.4.2 树突状细胞;FSC-Height;;Mo-DC成熟表型鉴定;3.4.3 调节性T细胞;FSC;FSC;3.5 检测细胞因子;3.5.1 胞内因子检测;目前并没有找到公认的细胞表面鉴别标志，所以仍以分泌的细胞因子来区分Th1和Th2细胞： Th1：CD4+IFN- γ+ Th2：CD4+IL-4+ Tc1：CD8+IFN- γ+ Tc2：CD8+IL-4+ Th17是最近发现的一种效应性CD4 + T细胞，以分泌IL-17为特征。 Th17：CD4+IL-17+ ;活化：自然状态下，静止的淋巴细胞不分泌或者分泌极少量细胞因子，刺激激活后，细胞内的细胞因子合成增加。常用的刺激剂有佛波酯PMA、离子霉素(Inomycin)、ConA、PHA、LPS等。 抑制分泌：细胞因子合成后很快就主动分泌到细胞外，位于细胞内的细胞因子的量很少，一般无法达到流式分析检测的最低标准，因此必须阻止细胞因子分泌到细胞外。蛋白质分泌抑制剂如莫能霉素(monensin)、BFA(brefeldin A)能抑制细胞因子分泌，使其累积在细胞内。;取抗凝血和培养基1:1等体积稀释，加入刺激剂PMA、离子霉素和阻断剂莫能霉素，37 ℃、5%培养箱4-6h； 取200ul，溶血后用PBS洗一遍； 细胞表面染色： 加PerCP-CD3和APC- CD8室温孵育20 min (PMA刺激后CD4分子会被内吞减少)； 固定、破膜后加PBS洗一遍； 细胞内染色：加入荧光抗体FITC-IFN- γ和PE-IL-4，混匀后避光孵育30min； 加2ml洗液，离心弃上清，加200ul PBS重悬细胞上机检测。 ;FSC-Height;细胞因子分析图;;3.5.2 CBA法;;CBA微球是包被有荧光染料的，一系列荧光强度不同的微球就能同时检