即时反录扩增.pdfVIP

第二章 即時反錄擴增 第一節 概述 一般檢測檢體為RNA形式，為了有效擴大檢體的量與訊號，因 此當取得檢體時，須利用反轉錄PCR的方式將檢體 RNA反轉錄為 cDNA再進行擴增。為了一邊有效擴增檢體並一邊定量與觀察基因表 現量，本研究利用 QuantitectTM probe Rt-PCR Kit進行即時反轉錄擴增 來達到此目的。 本研究所用之引子群與探針，利用設計核酸序列鑑識最小群引 子及特異群探針演算法(primer/probe design algorithm, PDA)包含設計 出最小群多用途引子(minimum-set mu-primers)及特異群探針 (unique probes) ，以最小群多用途引子對標的物進行聚合酶鏈反應增量，並 搭配特異群探針進行雜合反應 ，於最合理時間內快速有效地檢測獲 得最佳結果。 不同多用途引子之黏合溫度(Tm)具差異性，易於實際進行聚合 酶鏈反應造成困擾，故收斂所 有多用途引子之黏合溫度於特定合適 範圍，設計含有連接片段引子 (linker-primer)進行標準型兩階段聚合 酶鏈反應 (standard dual-phase PCR,簡稱 SDP)作為解決前述問題的標 準操作程序。 8 針對擴增出來的產物進行跑膠與探針陣列雜合的分析，來對引 子探針確效，並達到鑑別檢測之目標。 第二節 核糖核酸擴增方法 一、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR) ： 聚合酵素鏈鎖反應 (PCR)是一個簡便而有效的方法 ,它可使DNA 6 在試管中擴增至 10 X 以上。這個方法的原理十分簡單在要擴增的, DNA片段兩端分別設計一個正向引子 (forward primer)和反向引子 (reverse primer)使之與已變性的單股目標 DNA緩冷配對(annealing)後 , 利用 DNA聚合酵素 (DNA polymerase) 以目標DNA的兩股分別做為模 板(template)來合成新的DNA股。像這樣經由 (1)變性反應 (denaturation),使 DNA的兩股分離。 (2)緩冷配對反應(annealing) ，使 引子與目標 DNA配對。 (3)延長反應(extension) ，合成新的DNA股。 二、反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcrirption PCR) ： 反轉錄 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR) ，是聚合酶鏈反應 (PCR)的一種廣泛應用的延伸。在 RT-PCR中，一 RNA檢體被逆轉錄 成爲互補DNA(cDNA) ，再以此爲模板通過PCR進行DNA擴增。由一 條 RNA單鏈轉錄爲互補 DNA(cDNA)稱作「逆轉錄」，由依賴 RNA的 DNA聚合酶（逆轉錄酶）來完成。隨後，DNA的另一條鏈通過去氧 核苷酸引子和依賴DNA的 DNA聚合酶完成，隨每個循環倍增，即通 9 常的 PCR 。原先的RNA模板被 RNase H降解，留下互補 DNA 三、即時轉錄聚合酶鏈反應(real time PCR) Real-time PCR或稱 Quantitative PCR (Q-PCR)是一種藉著 PCR操 作協助定量 DNA or RNA (進行 RT-PCR) 濃度的方法。其原理是操作 PCR的同時，再加入一段螢光標記的探針 可與 ( DNA樣品互補) ，通 常是當這段探針與 DNA檢體互補時或者是在 PCR反應中被酵素裂解 掉，才會發散出螢光，所以隨著 PCR的循環次數愈多， DNA濃度愈 高，偵測到的螢光強度就愈高 。因此儀器內部會設定一個預期達到 的螢光強度，達到該螢光強度所需要的 cycle 次數 (稱 threshold cycle) 便與樣品原本 DNA濃度成反比。亦即 DNA 樣品濃度愈多， 可以較少的 threshold cycle便達到預測的螢光強度； DNA 樣品濃度 愈少，便需較多的 threshold cyc