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生物化学实验讲义 目 录 第一部分 生物化学实验基础 第二部分 实验项目 实验一 Folin－酚法测定蛋白质含量 实验二　 紫外分光光度法测定蛋白质含量 实验三　 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质 实验四　 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 实验五 SDS－PAGE测定蛋白质的相对分子量 实验六 酶的特异性、激活剂及抑制剂 实验七 酶促反应动力学实验 实验八 乳酸脱氢酶及其辅酶I的作用 实验九　 胰脏弹性蛋白酶的分离纯化（亲和层析法） 实验十 组织中核酸的分离及定量 实验十一 真核生物基因组DNA的制备（苯酚法） 实验十二 紫外分光光度法测定DNA与RNA含量 实验十三 琼脂糖凝胶电泳分离DNA 实验十四 质粒DNA的制备（碱变性法） 实验十五 动物组织总RNA的提取 实验十六 血清谷丙转氨酶活性的测定 实验十七 血糖的测定 实验十八 酮体的生成和利用 第一部分 生物化学实验基础 实验课的目的要求 【生化实验课的目的】 通过实验验证生化基本理论，加深理解。 通过实验学习并掌握生化基本操作技术，进行基本操作技能训练，培养独立工作能力，为后继课程的学习和从事科研工作打下基础。 通过实验培养学生独立思考和实事求是的科学态度，严谨的科学作风。 【生化实验课要求】 实验前预习实验内容，明确实验目的，理解实验基本原理及大体操作步骤。 实验中正规操作，掌握关键环节，认真观察，做好记录，综合分析，结果真实。 实验后及时总结，按时完成实验报告。 遵守实验室各项规章制度，爱护仪器。节约用试剂、煤气、水、电等，保持室内卫生。 注意安全。进实验室后熟悉水、电、煤气设备，实验后认真检查，杜绝事故发生。 生化实验的基本操作技术 1、吸管的使用 吸管是生化实验中最常用的量器，实验结果的准确程度与能否正确使用吸管有密切关系。因此必须正确掌握使用方法，熟悉各种吸管的规格，正规操作。 常用的吸管有刻度吸管，1、2、5、10mL等，也有0.1、0.2、0.5、0.01、0.05mL等微量吸管，使用时注意。 正确使用吸管。取液时，右手拇指的中指夹住管身上端，使食指能自由按住上口，用吸球取液体，待液面上升到所需刻度线的上方，迅速用食指按住上口，用滤纸擦去管下端外壁吸着的多余液体，然后稍松食指，调整液面下降到所需刻度。看刻度时使吸管垂直；液面与眼同高，看与液面凹面底部成切线的刻度。放液时，把吸管插进受器，使吸管尖端接触管壁，与受器成一定角度，使液体自然流出。或用食指与上口接触松紧控制流出速度。在使用吸管量取总量或用下段时，必须在液体流出后，停留10～15秒，转动吸管，使尖端内部液体流出。使用微量吸管时，放出液体后，靠壁停留10～15秒，然后把管尖端液体吹出。 2、玻璃仪器的清洗 生化实验所用器材必须清洁，以免杂质污染，影响实验结果。在定量分析实验中要求更加严格。一般清洗方法如下： 1）一般容器如烧杯、试管、三角瓶等用自来水冲洗，用毛刷蘸肥皂粉或去污粉刷洗，然后用自来水冲洗，器壁光洁不挂水珠，然后以少量蒸馏水冲洗3次。 2）吸管容量瓶等不能用毛刷刷洗，一般用自来水冲洗，然后用洗涤剂浸泡，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗3次。 洗涤液的配制 生化实验室常用的洗涤液是铬硫酸液，一般用浓度为5%、10%。 5%铬硫酸液的配制：取重铬酸钾粉末5g，放烧杯中，加水5mL，搅拌使其尽量溶解（可小火加热），然后缓缓加入粗浓硫酸100mL，边加边摇匀。溶液由红色变成棕红色，冷却后倒入有盖的容器内保存。 铬硫酸液清洁效力主要利用强氧化性。当遇有被氧化物质存在时，发生氧化还原反应，氧化作用很强，可以使有机物炭化，进一步氧化分解。硫酸越浓，铬酐越多，则清洁效力越强。当洗液变成绿色，即失去氧化能力。 注意事项： 1）重铬酸钾有毒，配制和使用时一定要注意，小心操作。 2）配制铬硫酸液时注意安全，要把硫酸缓慢地加到水里。 3）使用铬硫酸液时要小心，不要溅到眼、皮肤和衣服上。 4）用铬硫酸液浸泡仪器时，尽量把仪器先用水冲洗干净，并使其干燥，再浸入洗液内，以防吸水，可以较长时间使用。 液体的混匀 在生化实验中，除特殊情况外，一般每加一试剂后，都要随时混匀，以保证反应充分进行。不混匀则往往影响实验结果。简单介绍几种混匀液体的方法： 1）旋转：把容器圆形摇动，使液体旋转混匀。 2）振荡：将试管振荡、摇动。也可以用手掌稍加抵挡给以冲力，便于混匀。注意防止液体溅出。 3）搅拌：用干净玻璃棒搅拌混匀。 4）颠倒：当容器口细液体量较多时，可用瓶盖把口盖住，颠倒数次使液体混匀。如无瓶盖可用拇指或手掌按紧管口，颠倒数次，使液体混匀。 沉淀