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超滤法测定冬凌草甲素血浆蛋白结合率 　　[摘要] 目的 测定冬凌草甲素在健康人血浆、大鼠血浆和家兔血浆中的蛋白结合率，为设计合理的给药方案提供依据。 方法 采用超滤法结合高效液相色谱法（HPLC）对冬凌草甲素与大鼠、家兔和健康人血浆的蛋白结合率进行测定。 结果 冬凌草甲素在覆盖临床给药范围的5.4，21.6和108.0 μg/mL下与健康人血浆的血浆蛋白结合率分别为80.6%，78.3%，76.2%，与大鼠的血浆蛋白结合率分别为69.3%，67.5%，68.1%，与家兔的血浆蛋白结合率分别为65.2%，66.7%，64.3%。覆盖临床给药浓度的3个浓度的冬凌草甲素在同种血浆中血浆蛋白结合率差异无统计学意义（P 0.05）。 结论 结果表明本法简便快速、灵敏度高、专属性好，能够满足测试生物样品的要求，超滤法结合高效液相色谱法可用于冬凌草甲素血浆蛋白结合率的检测。在本研究试验浓度范围内，冬凌草甲素的血浆蛋白结合率与药物浓度无显著相关性，不同种血浆的蛋白结合率试验结果表明，冬凌草甲素与健康人血浆、大鼠血浆和家兔血浆蛋白均具有中等强度的结合。 [关键词] 冬凌草甲素；血浆蛋白结合率；超滤法；HPLC [中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（a）-0025-03 冬凌草甲素（oridonin）是唇型科香茶菜属植物冬凌草Rabdosia rubescens（Hemsl.） Hara.中提取的一种贝壳杉烯二萜类化合物，具有较强的抗肿瘤活性，对人胃癌SGC-7901细胞、食道癌109细胞、肝癌BEL-7402细胞等多种肿瘤细胞均呈现较好的抑制作用，而对正常细胞毒性较低[1]。目前临床多用于食管癌、贲门癌、肝癌、食道癌和胰腺癌的治疗[2]。虽然冬凌草甲素抗肿瘤作用显著，但由于冬凌草甲素的水溶性差[3]、半衰期短、生物利用度低和在水溶液中稳定性不好[4]等原因，其临床应用受到限制，目前临床上使用较广的仅有“癌得宁注射液”，癌得宁注射液通过使用表面活性剂和有机溶剂来增大冬凌草甲素的溶解度，达到临床给药浓度，但制剂刺激性大，长期使用容易引发静脉炎等不良反应[5]。为解决上述问题，国内外已开展多种新剂型的冬凌草甲素注射给药研究[6-8]。药物血浆蛋白结合率对于设计合理的给药方案和新药安全评价具有重要意义[9-12]，本文测定了冬凌草甲素在健康人血浆、大鼠血浆和家兔血浆中的血浆蛋白结合率，为冬凌草甲素新型制剂的研发奠定实验基础。冬凌草甲素稳定性不好，为了避免冬凌草甲素溶液在进行血浆蛋白结合率试验时长时间放置降解对研究结果造成误差，本文采用超滤法进行冬凌草甲素血浆蛋白结合率的研究。 1 仪器与试药 1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱系统（美国安捷伦公司）；XW-80A旋涡混合仪（上海医科大学仪器厂）；Beckman Allegra 64R高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；DSHZ-300型水浴恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂）；Anke TGL-16G型飞鸽离心机（上海安亭科学仪器厂）；Millipore 10K超滤管（美国密理博公司）。 1.2 试药 冬凌草甲素（成都兰贝植化科技有限公司，批号：100822，含量不低于98%））；冬凌草甲素对照品（含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号：110721-200501），色谱纯甲醇（山东禹王实业有限公司），水为超纯水，ProElut C18 SPE小柱（200 mg，3 mL，DIKMA公司），其他试剂均为分析纯。大鼠、家兔血浆（自制，实验动物由中国医科大学动物实验中心提供），健康人血浆（由中国医科大学附属第一医院提供）；本研究由中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准，健康志愿者试验前签署知情同意书。 2 方法与结果 2.1 分析方法建立 2.1.1 色谱条件 色谱柱： Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（55∶45）；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；检测波长：240 nm；进样量10 μL；理论塔板数按冬凌草甲素色谱峰计大于3000，保留时间约为7.2 min，色谱图见图1。 图1 空白血浆（A）和冬凌草甲素血浆样品（B）的色谱图 2.1.2 对照品溶液的配制 精密称定冬凌草甲素对照品10.8 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，即得浓度为1.08 mg/mL的冬凌草甲素储备液，4℃冰箱冷藏备用。 2.1.3 样品前处理方法 先用2 mL甲醇活化固相萃取小柱，再加入2 mL水平衡小柱，然后注入200 μL超滤液进行固相萃