以花药为受体小麦转基因技术体系构建.docVIP

以花药为受体小麦转基因技术体系构建 　　摘要：为了在转化当代获得纯合的转基因株系，本试验对以小麦花药为受体的转基因方法进行了系统研究。结果表明，金粉粒度0.6μm、金粉浓度100μg/枪、轰击距离6cm、轰击压力1300psi为基因枪转化小麦花药的最佳参数组合。用含有5%DMSO的0.2%秋水仙碱溶液处理单倍体植株4h，染色体加倍效率最高，达到100%；用含1%DMSO的溶液处理12h加倍效率最低，为62.2%。PCR结果显示所有T0代阳性植株在T1代都无分离，说明该方法得到的转基因株系在T0代即为纯合系。本研究成功建立了以花药为受体的小麦转基因技术体系，为小麦遗传改良提供了一种新的方法。 关键词：小麦；转基因；受体；花药；染色体加倍 中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）01-0001-06 小麦是重要的粮食作物之一，小麦生产的可持续性对于保障粮食安全至关重要。然而，由于缺少高抗生物或非生物逆境的小麦种质资源，在有限的土地资源上进一步提高小麦产量异常艰难。转基因技术为利用异源基因改良小麦的抗逆性、实现种质资源创新的新突破提供了新的机遇[1]。 愈伤组织诱导和再生是小麦转基因的关键步骤，迄今为止，已成功用于小麦遗传转化的外植体有幼胚[2，3]、幼穗[4]、花药诱导后的胚状体[5，6]、小孢子[7]、成熟胚[8]等。这些外植体中，除了花药诱导后的胚状体和小孢子为单倍体外，其余皆是二倍体。由于小麦基因组庞大，含有42条染色体，转基因后代纯合过程较慢。而以单倍体为受体的转基因植株经过染色体加倍，可以在转化当代获得纯合株系，大大缩短出圃年限。影响染色体加倍效率的因素有很多，植株的发育状态、试剂的种类、处理时间等都会对加倍效率产生影响[9]。秋水仙碱是目前应用最为广泛的加倍剂，但处理不当会对植株产生致死性的伤害[10]。 到目前为止，未见有以小麦花药作为转基因受体的报道。以花药为受体的小麦转基因技术首先要获得转化的单倍体植株，然后经过染色体加倍得到可育的转基因后代。为了建立以小麦离体花药为受体的外源基因导入技术体系，探索高效的染色体加倍技术，本试验对影响小麦基因枪转化和单倍体加倍的因素进行了详细的研究，建立了以花药为受体的小麦转基因技术体系。 1材料与方法 1.1质粒及试剂 本试验所用的质粒为pHAC25，由山东省农业科学院作物所分子生物学实验室保存。 质粒提取试剂盒购自天根生物；培养基配制所需的无机盐购自国药集团；维生素和抗生素以及激素、GUS染色所需的药品购自Sigma公司；金粉及基因枪转化过程中所需的耗材均购自伯乐公司。 1.2花药的分离与预处理 花药供体品种为K35，是山东省农科院作物所自行选育的具有良好花药培养能力的高代小麦品系。显微镜下观察花药发育情况，选择单核靠边期的花药（图1A），放入盛有0.3mol/L甘露醇预处理液的培养皿中，每皿500粒，4℃放置约16h（图1B）。将浸泡完全的花药转移到诱导培养基上（培养皿下放有画有基因枪轰击圈的白纸），每皿500粒，用于基因枪转化。 1.3子弹制备与花药转化 取金粉10mg，70%乙醇冲洗，10000r/min离心1min，重复3次，加入1ml灭菌水振荡2min，制成终浓度为10μg/μl的金粉贮藏液。将金粉贮藏液充分涡旋，取100μl放入硅化的1.5ml离心管中，14000r/min离心30s，弃上清；加入50μl灭菌水悬浮金粉，在振荡器上边轻微振荡边加入1μg/μl的质粒10μl，再加入20μl新配制的0.1mol/L的亚精胺和50μl2.5mol/L的CaCl2，高速蜗旋3min，将离心管在冰上放置约2min让金粉自然沉淀，10000r/min离心10s，弃上清；加入无水乙醇750μl，高速蜗旋，冰上放置约2min让金粉自然沉淀，10000r/min离心10s，弃上清，用100μl无水乙醇悬浮。 将制备的子弹用基因枪轰击预处理后的花药。 1.4诱导培养与再生苗的筛选及染色体加倍 于无菌操作台中将轰击后的花药转移到花药愈伤诱导培养基上（图1C），32℃暗培养3d后，28℃暗培养约4周，获得胚状体（图1D）。将1～2mm左右的胚状体转移到含有5mg/Lbiolaphos的再生培养基上，25℃下进行再生筛选培养（每天光照16h，光照强度5000lx）。 将高5cm左右的再生苗移栽到装有栽培基质的花盆中，用打孔的废弃矿泉水瓶罩住小苗，昼夜温度保持14℃，每天光照14h。有2～3个分蘖时，将幼苗从花盆中取出，流水洗净根部，修剪幼苗，使根长或叶长保留3cm左右。将修剪好的幼苗根部完全浸入含有不同浓度DMSO的0.2%的秋水仙碱加倍液中，18℃恒温培养