外源性IGF-I对大鼠运动骨骼肌mTOR及下游信号影响.docVIP

外源性IGF-I对大鼠运动骨骼肌mTOR及下游信号影响摘 要： 目的：通过观察一周注射外源性IGF-I和跑台运动对mTOR及其下游信号的影 响，以深入探讨IGF-I对运动骨骼肌蛋白合成信号的影响机理。方法：8周龄雄性SD鼠在适应 性训练后分为四组：安静组（S）、IGF-I组（SI）、运动组（E）、运动+IGF-I组（EI）， 每组6只。运动方式为跑台运动（坡度为10%，跑速20 m/min，60min），每天一次，共7 d。 外源性IGF-I为小腿后侧肌肉隆起处的皮下注射。用Western Blotting法检测腓肠肌MHC、mT OR（Ser2448）、p70??S6K?（Thr389）和4EBP1（Thr37/46）的磷酸化表达。结果：在一 周后，外源性IGF-I显著促进骨骼肌湿重和MHC的表达。外源性IGF-I和运动均显著促进骨骼 肌mTOR（Ser 2448）（?P? 在适应性训练后，动物经体重分层后随机分为四组：安静组（S）、IGF-I组（SI）、运 动组（E）、运动+IGF-I组（EI），每组6只。各组体重无显著差异。 1.2 动物运动方案 正式训练前，动物在跑台上进行4 d的适应 性训练，之后休息3 d。适应性训练方案见表1。 正式实验共7 d，安静组常规饲养，运动组进行7 d的运动，运动方案为上坡跑（坡度为10% ），速度20 m/min，每天训练60 min。（根据Bedford经验公式，相当于75%VO?2max）?? ［3］。运动时间为每日上午8:00-9:00。 1.3 IGF-I注射方案 IGF-I为大鼠小腿后面肌腹隆起处的皮下注 射。每天运动后即刻，SI和EI组在大鼠小腿后肌腹隆起处的皮下注射IGF-I。其他组注射同 等剂量的生理盐水。具体剂量安排如表2。 1.4 测试样本采集与处理 ??取材前禁水禁食12 h，以0.3 m L/100 g为剂量，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后腹主动脉取血，然后速取后肢腓肠肌。 接着用生理盐水将其洗净，剔除肌腱及筋膜组织，用干净滤纸将其吸干，用锡纸将其包裹后 迅速投入液氮，而后置于-80℃冰箱保存待测。 1.5 指标测试方法 1.5.1 提取蛋白 匀浆缓冲液的配制：取RIPA裂解液100 mL， 分别加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂（Roche公司）各10片，最后取100 mM PMSF 1 0 00 ?加入。PMSF于临用前数分钟加入。于匀浆前新鲜配制。 用精密天平称取腓肠肌120 mg，用眼科剪迅速剪碎，按1:10比例向玻璃匀浆器中加入预冷的 裂解液，再在冰水浴中进行匀浆，直至没有肉眼可视的悬浮物。将组织匀浆液倒入1.5 mL EP管中，静置10 min。于4℃，12 000 g，10 min离心，取上清液，分装后保存于-80℃待测 。 1.5.2 蛋白浓度测试（Bradford法） 配制Bradford工作液： 按照《精编分子生物学实验指南》配制［4］。 标准曲线制备：用1 mg/mL BSA标准蛋白分配制0、10、20、40、60、80、100 梯度。 加入5 mL Bradford工作液，用旋涡混匀器混匀后静置5 min。测A595nm。制作标准曲线后， 再分批次测试样品浓度。 1.5.3 Western Blot测试Tris-甘氨酸电泳缓冲液、上样缓冲液、电转液、堆积胶和分离胶的配制均参照《Curre nt protocols in protein science》实验方法［5］，TBS、TBST、封闭液按照CellSignaling抗体说明书的要求配制。 取100 总蛋白配制成上样体系，置95℃沸水中 5 min，再于4℃中冷却，上样前以3 000rpm离心5 min。配制分离胶6%（MHC、mTOR）、8%（Actin、p70S6K）、10%（ -actin）或 16.5%（4EBP1），以及5%浓缩胶。浓缩胶用80V恒压，分离胶换120V恒压电泳。再用半干转 将蛋白转到NC膜上，以恒压20 V半干转。封闭90 min后用加入一抗，不同抗体稀释比例分别 为 -actin（购自Santa Cruz公司）为1:500，Fast Myosin Skeletal Heavy chain antibo dy ［MY-32］（Abcam公司）为1:2 000，Phospho- mTOR(Ser2448)（Cell Signaling公司） 为1:800，Phospho-p70??S6K?（Thr389）（Cell Signaling公司）为1:1 200，Phospho-4E-B P1（Thr37/46）（Cell Signaling公司）为1:800，然后4℃孵育过夜