第一章蛋白质3和第二章酶.ppt

蛋白质分离纯化的一般原则;一、蛋白质分离、纯化、鉴定 的一般原则;第一步是前处理（pretreatment） 分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丧失生物活性。为此，应根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。;破碎;第二步是粗分级(rough fractionation) 当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开。一般这一步采用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。 ;结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。 尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中数量占一定优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。蛋白质纯度越高，溶液越浓，就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。 ;二、蛋白质的提取与纯化方法; ;（一）改变蛋白质的溶解度;（一）根据蛋白质分子大小分离方法;透析(dialysis):;超过滤（ultrafiltration）: 在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的 超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被 截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化 蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。 ;凝胶过滤（gel filtration）： 凝胶过滤又称分子筛层析，在层析柱内填充惰性的 微孔胶粒（如交联葡聚糖），将蛋白质溶液加入柱上部 后，小分子物质通过胶粒的微孔进入胶粒，向下流动的 路径加长，移动缓慢；大分子物质不能或很难进入胶粒 内部，通过胶粒间的空隙向下流动，其流动的路径短， 移动速度较快，从而达到按不同分子量将溶液中各组分 分开的目的 ;;;　　根据各种蛋白质在一定的pH环境下所带电荷种类与数量不同的特点，将不同蛋白质予以分离。 常用的方法有： 　　离子交换层析 　　电泳 　　;;;;电泳;原点;（三）以溶解度为基础的方法;*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 ;（四）以蛋白质的特异性相互 作用为依据的方法;;三、蛋白质含量测定及纯度鉴定 ;（二）测定蛋白质混合物中某一特定 蛋白质的含量 （三）鉴定蛋白质制品的纯度 1.电泳分析 2.沉淀分析 3.扩散分析 ;第五节 蛋白质测序;蛋白质一级结构的测定;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;（一）、蛋白质测序策略;两类多肽链末端氨基酸残基： N-端氨基酸 C-端氨基酸 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 ;Sanger法 ;二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高 ;;肽链外切酶:从多肽链N-端逐个向里水解 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 —水解以Leu残基为N-末端的肽键速度最大。;肼化物可与苯甲醛缩合成不溶于水的物质;（二）、末端氨基酸残基的鉴定;肽链外切酶:从多肽链C-端逐个水解 四种羧肽酶：A,B,C和Y； A和B(胰脏)、C(柑桔叶)、Y(面包酵母) ∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA残基 ∽B:只水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键 ;（三）、二硫键的断裂;1、酸水解; 1、酶解法: 内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶 ;R1=Lys（K）和Arg（R） 专一性较强，水解速度快 R2=Pro（抑制）;R1=Phe（F）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AA Leu、Met和His稍慢 R2=Pro（抑制） pH8-9;R2=Phe（F）、 Trp（W）、 Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快 ;R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、 Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快 R1=Pro（抑制） pH2 ;肽链;2、化学裂解法 ①溴化氰水解法(Cyanogen bromide) ——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。 ; ②NH2OH断裂： 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂 ;;胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链 经电泳分离各肽段 用过甲