第十一章动物细胞融合和杂交瘤技术 演示文稿.ppt

《生物工程总论》之 “细 胞 工 程” 篇 专业：生物工程 授课人：苗永美 讲授内容及学时分配表 第一章 绪论 2学时 第二章 实验室的组成及无菌操作技术 2学时 第三章 植物细胞工程的基本原理 3学时 第四章 植物离体无性快繁和脱毒技术 2学时 第五章 植物细胞培养及次生物质的生产 3学时 第六章 原生质体培养和体细胞杂交 3学时 第七章 植物花粉、花药及单倍体育种 2学时 第八章 植物胚胎培养 1学时 第九章 种质资源的离体保存 1学时 第十章 动物细胞培养技术 3学时 第十一章 动物细胞融合和杂交瘤技术 2学时 第十二章 动物胚胎工程 3学时 第十三章 动物干细胞技术 2学时 第十一章 动物细胞融合与杂交瘤技术 一、动物细胞融合技术 二、杂交瘤技术与单克隆抗体的生产 一、动物细胞融合技术 Muller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 一、动物细胞融合技术 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。 仙台病毒诱导融合机理是： 病毒囊膜上的刺突（具凝血活性何唾液酸苷酶活性）与细胞膜上糖蛋白起作用，使细胞发生凝聚，使膜上的蛋白质使脂类分子重排，打开质膜，导致细胞融合。 仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段： ①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上，并使两细胞相互凝聚； ②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2； ③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP； ④融合成巨大细胞，仍需ATP 。 病毒诱导融合法的特点： 优点：对各种动物细胞都适宜；病毒繁殖量大，易培养。 缺点：制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低，另外病毒可能会对细胞的生命活动产生干扰等。 目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室研究。 2、聚乙二醇诱导融合? 　　继高国楠(Kao) 用PEG成功诱导植物原生质体融合后，1975年，Potecrvo用该法成功融合动物细胞。该法以其特有的优势迅速取代病毒诱导动物细胞融合。 3、电诱导融合 同植物原生质体融合 聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤 （1）将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； （2）离心沉淀，吸去上清液； （3）加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟； （4）加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； （5）加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。 （6）6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。 二、杂交瘤技术与单克隆抗体的生产 （一）何谓单克隆抗体？（monoclonal antibody,McAb） 抗体（Antibody,Ab）：是指能和相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 抗原(Antigen，Ag)：能启动机体的免疫应答，且能与其免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)特异性结合，并发生一系列生物学效应的物质。 免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）:是指具有抗体活性的或化学结构与抗体相似的球蛋白。 抗体和免疫球蛋白的关系：抗体是免疫球蛋白，并非所有的免疫球蛋白都具有抗体活性。 （抗体结构图） 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。 免疫球蛋白的基本结构 抗原决定簇：存在于抗原分子表面（有的在内部），决定该抗原特异性的特殊化学基团。 抗原以抗原决定簇与相应淋巴细胞的抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答； 抗原与相应抗体的特异性结合也通过抗原决定簇来完成 。 每一个抗原决定簇，其性质和空间构型决定着一种特异性，可与一种抗体结合。一个抗原分子可以有一种或多种不同的抗原决定簇 单克隆抗体（McAb）的应用： 主要用于疾病的诊断、治疗和预防。 如各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病的诊断。 在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫