基因诊断与基因治疗-医学生物化学-课件-上海交通大学医学院-21.ppt

第二十一章 基因诊断与基因治疗 第一节 基因诊断 疾病的根本原因: 疾病的各种表型的改变 是基因的改变造成的 基因诊断: 采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构(DNA水平)或功能(RNA水平)是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。是病因的诊断。 二、基因诊断的原理和方法 1、基因诊断的原理： DNA诊断----检测相关基因的机构及其表 达功能特别是RNA产物是否正常。 RNA诊断----对表达产物mRNA质和量表 化的分析。 1、基因诊断的方法 核酸分子杂交技术 聚合酶链反应 (PCR) 基因测序 基因芯片 （1）DNA诊断 斑点杂交 等位基因特异寡核苷酸探针 (allele specific oligonucleotide, ASO) PCR/单链构象多态性分析（SSCP） (single strand conformation polymorphism, SSCP) 限制性内切酶谱分析法 DNA限制性长度多态性 (restriction fragment length polymorphism, RLFP)分析 PCR/单链构象多态性分析（SSCP） PCR产物变性后， 经聚丙烯酰胺凝胶电泳， 正常基因和变异基因的迁移位置不同， 可分析确定致病基因的存在。 （2）RNA诊断 RNA印迹（Northen blot） 是检测基因是否表达、表达产物mRNA的大小及基因表达的效率。 RT-PCR 三、基因诊断的应用 1、遗传疾病 2、感染性疾病 （1）病毒性感染 （2）细菌性感染 （3）寄生虫 （4）其他 3、恶性肿瘤 4、法医学中的应用 （1）DNA指纹分析（DNA fingerprinting） （2）短串联重复多态性分析 　　（short tandem repeat，STR） 遗传性疾病----DMD的分子诊断 遗传性疾病----DMD的分子诊断 X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病,发病率 为1/3 500个男孩 DMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2500Kb DMD基因的突变导致dystrophin缺陷 检测DMD基因的技术： Southern印迹、多重PCR DMD的基因检测 迪谢内肌营养不良 (DMD) 是一种高发病 率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗 传性疾病，在2500个活产男婴中即有一 个患者。 致病基因DMD的全长为250kb，有79个外 显子。 DMD 的最主要遗传缺陷是外显子缺失， 约占60%~70%。 DMD基因外显子缺失的检测 感染性疾病的分子诊断 SARS相关冠状病毒的分子诊断 SARS相关冠状病毒的分子诊断 2003年4月，香港研究者Peiris等报 告了50 例SARS病人的临床表现和 病毒学研究结果证明，新冠状病毒 可能是SARS的致病原因。 （Lancet, 2003, 361: 9365) 其它实验室陆续得出相同结论。 2003年4月，德国汉堡Bernhard- Nocht热带医学研究所学者 Drosten 等用随机扩增技术，获得长度为 300 bp的核苷酸序列。 根据这段序列，建立了检测新冠状 病毒的常规和实时定量PCR技术。（ on April 10, 2003） 引物和探针 BNIoutS2--BNIoutAs BNI-1片段，189 bp BNIinS--BNIinAs BNI-1片段的内套片段，108bp BNITMSARS1—BNITMSARAs2 BNITMSARP(荧光素标记的探针） 产物长度：77 bp 检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺 泡灌洗液 、血浆、粪便。 检测方法 1. 逆转录-巢式PCR 2. 逆转录-实时PCR 结 果 病人和接触者（具临床症状）的痰 液中用外套引物检测到了病毒。 病人的其它标本用套式PCR检测到 病毒。 有报道显示，在可能SARS病人 中， 病毒的检出率为100%。 在疑似SARS病人中的检出率为 23%。 所有健康接触者中未检测到病毒。 检测病毒的3种方 法（血清学检测、 病毒分离、PCR技术）中，PCR技 术的检出率最高。 讨 论 疾病的早期即可获得阳性结果（早 于血清转换期）。 特异性较高（SARS患者