第07章 蛋白质的分离、纯化和表征.pptVIP

南昌大学生命科学院 李思光 生物化学网络教程 蛋白质的分离、纯化和表征 章 节 目 录 一、蛋白的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小与形状 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质分离纯化的一般原则 五、蛋白质的分离纯化方法 蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保留着游离的末端α-氨基和α-羧基以及侧链上的各种功能团。因此蛋白质的化学和物理化学性质有些是氨基酸相同的，例如，侧链上功能团的化学反应，分子的两性电解质等。 蛋白质和游离氨基酸中相应基团的pKa值不完全相同 天然球状蛋白质的可解离基团大多数可被滴定，某些天然蛋白 质有一些可解离基团由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能被滴定 蛋白质的等离子点：在没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH 一、蛋白的酸碱性质 蛋白质是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。 蛋白质的等电点：蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等时的pH。 蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下可以发生明显变化 （一）根据化学组成测定最低相对分子质量 （二）渗透压法测定相对分子质量 （三）蛋白质的扩散和扩散系数 （四）沉降分析法测定相对分子质量 （五）凝胶过滤法测定相对分子质量 （六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 二、蛋白质分子的大小与形状 （一）蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相当稳定的。 蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布郎运动以及不能通过半透膜等性质。 （二）蛋白质的沉淀 盐析法 使蛋白质脱去水化层 有机溶剂沉淀法 使蛋白质脱去水化层、降低介电常数 重金属盐沉淀法 pH大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷，容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 pH小于pI时，蛋白质颗粒带正电荷，容易生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。 加热变性沉淀法 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （一）根据分子大小不同的纯化方法 （二）利用溶解度差别的纯化方法 （三）根据电荷不同的纯化方法 （四）利用选择性吸附的纯化方法 （五）利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法 （六）高效液相层析和快速蛋白质液相层析 透析和超过滤、密度梯度离心、 凝胶过滤 等电点沉淀和pH控制、 有机溶剂分级分离、盐溶和盐析 聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳 等电聚焦、层析聚焦、离子交换层析 羟磷灰石层析、疏水作用层析 五、蛋白质的分离纯化方法(1) 柱层析 蛋白质的分离纯化方法(2) 离子交换层析 - 混合物中不同组分对树脂中带电基团的亲合力将受到溶液pH (决定各组分的电离状态)和游离盐离子浓度的影响； - 对阳离子交换剂亲合力低 (电负性更强)的组分流经层析柱的速度更快； - 与阳离子交换剂结合最紧密(电正性最强)的组分则可通过用盐浓度更高或不同pH的缓冲液将其最后洗脱 蛋白质的分离纯化方法(3) 凝胶过滤 凝胶过滤的原理： 当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。 蛋白质的分离纯化方法(4) 亲和层析 蛋白质的分离纯化方法(5) 亲和层析是利用蛋白质分子对其配体 分子特有的识别能力，也即生物学亲 和力，建立起来的一种有效方法 电泳 蛋白质的分离纯化方法(6) 小结 蛋白质是一种两性电解质。它的酸碱性质主要性质决定于肽链上可解离 的R基团。对某些蛋白质来说，在某一pH值下它所带的正电荷和负电荷相 等，即净电荷为零，此pH称为蛋白质的等电点。蛋白质处于等电点时溶解 度最小。在无盐类干扰情况下，一种蛋白质的质子供体基团解离出来的质 子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH是它的真正等电点，称为等 离子点，它是蛋白质的特征常数。 蛋白质溶液是亲水胶体系统。蛋白质分子颗粒周围的双电层和水化层是 稳定蛋白质胶体系统的主要因素。 分离蛋白质混合物的各种方法主要根据蛋白质在溶液中的性质：a 分子 大小、b 溶解度、c 电荷、d 吸附性质、e 对配体分子特异的生物学亲和力 蛋白质制品的纯度鉴定通常采用分辨率高的物理化学方法，例如PAGE、 等电聚焦、毛细管电泳、沉降分析和HPLC等。如果制品是纯的，在这些 分析的图谱上只呈现一个峰或一个条带。