OATP1B1与CYP3A4基因多态性对阿托伐他汀转运代谢影响的分子机制的分析研究.pdfVIP

摘要 摘要 背景： (HMG．CoA)还原酶抑制剂，可竞争性抑制胆固醇的生物合成，显著降低血脂 水平。虽然ATV己广泛用于高胆固醇血症的治疗，但其调脂疗效呈现明显的个 体差异仍给临床应用带来困扰。有研究表明，ATV与其他他汀类不同之处在于， CYP3A4的基因多态很可能影响ATV的转运与代谢，从而导致ATV疗效和副作用 的基因多态性及其相互问的关联意义重大。 目的： 同OATPlBl基因型个体中药物体外转运的差异；通过野生型及不同位点突变型 究所获数据，探讨ATV在不同基因型个体中转运和代谢差异的分子机制及二者 的关联性；为ATV在临床的合理应用提供理论与实验依据。 方法： 样品及HEK293T细胞样品处理方法。 2、构建稳定表达目的基因的细胞模型。将携带OATPlBl木15．GFP融合基因 的慢病毒(OATPlBl木15质粒构建、慢病毒包装、滴度测定由上海吉凯基因完成) 三种细胞模型比较ATV在不同基因型0ATPlBl个体中摄取转运过程的差异。 验分为空白对照组、OATPlBl木1a、木5及唪15三种质粒组，考察摄取缓冲液PH对 摘要 LC．MS法测定细胞样品中ATV的量，比较ATV在三种不同基因型质粒模型中的 影响。 4、ATV在野生型及不同位点突变型CYP3A4重组酶系中体外酶促动力学分 析。实验分为空白对照组和CYP3A4木1(谢ld 组酶组，每组分别加入系列浓度的ATV 10“l，孵育体系中重组酶终浓度为 法测定孵育体系中ATV及其代谢产物的量，比较ATV在CYP3A4野生型与突变型 变对ATV代谢的影响。 5、数据处理与统计分析。所有数据均以平均数士标准差(mean土SD)表示， 型中摄取动力学参数，以及ATV在野生型和突变体重组酶系药物代谢动力学参 数。采用SPSS12．0软件进行统计分析，组问差异采用t检验，统计结果以P0．05 表示差异无统计学意义，PO．05表示差异有统计学意义，PO．01表示显著性差异。 结果： 1、建立的LC．MS检测方法完全能够符合ATV生物样本分析测试的要求，建 立的HPLC检测方法符合ATV及其代谢产物分析测试的要求，两种检测方法均具 有较高的灵敏度和特异性；成功建立ATV的重组蛋白酶样品及HEK293T细胞样 品处理方法，为本课题实施奠定了可靠基础。 HEIQ93T后，通过荧光检测，观察到GFP的表达，荧光表达随着时间延长及感 时Lenti．0ATPlBl木15感染HEK293T的感染率可达80％；通过WestemBlot检测感 型构建成功。 摘要 (388AG 无统计学意义(P0．05)。 88．65士19．32 P450、0．18；突变型CYP3A4卡3酶促 uM、16．39士4．10pmol／mi邮mol 动力学参数Km、Vmax及CLi。t值分别为92．58士9．33pM、23．86士5．02pmol／mill／pmol P450、O．41，其活性 及CLi。c值分别为109．38士8．21pM、44．84士6．73pmol／min／pmol P450、0．10，其活性显著低于野生 156．87土20．87“M、15．67士6．03pmol／min／pmol oo．37士l8．09 型；突变型CYP3A4}l8酶促动力学参数Km、Vmax及CLint值分别为l P450、0．1 8，其代谢ATV的活性与野生型相近。 ¨M、18．48土5．63pmol／min／pmol 结论： 多态性对ATV代谢影响的机制。 1、结果提示，OATPlBl52l位点可能是ATV转运的分子作用点，也是影响 OATPlBl对ATV转运能力的关键位点。该位点发生突变会导致转运入肝至靶点