用于中药复方物质基础探究Caco―2细胞胶原包被6孔转运板体系构建.doc

用于中药复方物质基础探究Caco―2细胞胶原包被6孔转运板体系构建 　　摘要： 6孔转运板胶原包被后进行Caco-2单层细胞培养，测定不同的胶原种类、鼠尾胶原铺胶浓度和铺胶时间下Caco-2细胞单层的跨膜电阻以及阳性药物普萘洛尔和阿替洛尔的被动扩散表观渗透系数，发现不同胶原包被条件对Caco-2细胞单层的完整性和转运能力无明显影响。因此2 μgcm-2鼠尾胶原铺胶1 h即可构建稳定的Caco-2细胞培养的胶原包被6孔转运板体系，为研究中药复方物质基础的吸收提供体外研究技术方法。 关键词： Caco-2细胞单层；6孔板；胶原；跨膜电阻；表观渗透系数 [收稿日期] 2013-09-28 [基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09502-006）；国家科技支撑计划项目（2011BAI07B08） [通信作者] 杨秀伟，教授，Tel：（010E-mail： xwyang@bjmu.edu.cn [作者简介] 杨雁芳，讲师，研究方向为天然药物成分的ADMET/Act.研究，E-mail： yangyanfang@bjmu.edu.cn Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞系（human colon adenocarcinoma cell line），是目前常用的研究药物肠吸收、转运和吸收机制的体外培养模型[1]。中药复方是中医临床用药的特点和优势，是中医药防病治病的主体，中药物质基础研究应以复方为载体，遵循整体性原则，寻找或建立科学、快速、准确的研究方法。在中药复方化学成分的Caco-2细胞肠吸收转运研究中，需要通过增大给药池的体积才能有利于转运后待测物的富集、检测，甚至微量成分的检测，但在实际操作过程中，由于Caco-2细胞较长的培养周期容易使细胞在增大的膜面积上发生脱落，细胞单层平整性容易变差，进而单层通透性变高而不能真实反映药物的吸收过程。本项研究选择细胞培养中常用的天然黏附剂鼠尾胶原（rat tail collagen，RTC），研究胶原包被对Caco-2细胞单层稳定性的影响，以期建立适用于中药复方物质基础研究的6孔板Caco-2细胞单层吸收转运模型。 1 材料 1.1 细胞株 Caco-2细胞株（ATCC #HTB-37）购自美国ATCC（American type culture collection）。 1.2 药品与试剂 DMEM（Dulbecco′s modified eagle′s medium，1237317）、胎牛血清（FBS，989267）、非必需氨基酸（NEAA，1212513）、胰蛋白酶、磷酸缓冲液（PBS）购自美国Gibco公司，普萘洛尔、阿替洛尔、二甲基亚砜（DMSO）、Ⅰ型鼠尾胶原（RTC）购自美国Sigma-Aldrich公司，青链霉素混合液购自北京索莱宝科技有限公司。6孔聚碳酯膜转运板（Transwell，#3414）、COL嵌套6孔转运板（Transwell，#3492），25 cm2及75 cm2细胞培养瓶购自美国Corning Costar公司。甲醇、乙腈（色谱纯）购自美国J. T. Baker公司。 1.3 仪器 Galaxy B型CO2气体培养箱（英国RS Biotech公司）；Evom细胞电阻仪（World Precision Instrument，Sarasota，FL，美国），XDS-1倒置显微镜（重庆光电仪器公司），STIK高压蒸气灭菌器（上海施都凯仪器设备有限公司），GRX-9051B型热空气消毒箱（上海福玛实验设备有限公司），HZS-H型恒温水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），TGL-16C 型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），岛津高效液相色谱（HPLC）仪，配置LC-10AT vp泵，SPD-M10A vp检测器，Class-vp数据处理工作站（岛津，日本）。 2 方法 2.1 溶液配制 完全DMEM液-10和-20，PBS， HBSS（Hanks′ Balanced Salts Solution）平衡盐等溶液的配制见文献[2-3]。 2.2 胶原包被Transwell嵌套 用无菌水将鼠尾胶原稀释成0.5 gL-1储备液，按照2， 4， 6， 8， 10 μgcm-2的包被浓度制备适量的包被工作液（6孔板的嵌套面积为4.67 cm2）。将胶原包被工作液0.6 mL加入到6孔板的Transwell嵌套中，在超净台中放置适当时间（1 h或2 h），使其干燥并部分包被。吸走嵌套中剩余的胶原溶液，立即用1 mL PBS漂洗后，嵌套即可使用。实验过程设定未经胶原包被的6孔板（#3414）作为空白对照。实验中使用的2种转运板的型号和