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等位基因特异性PCR在ACE基因多态性检测中应用 　　【摘要】 目的：采用等位基因特异性PCR法对ACE基因多态性进行检测，并对脑血管疾病（CVD）与ACE基因多态性的相关性进行探讨。方法：将2010年2月-2013年2月云南景颇族和傣族共73例CVD患者（CVD组）和43例健康人员（对照组）进行ACE基因多态性检测，并对结果进行分析。结果：116例受检人员均获得扩增产物，CVD组患者73例扩增产物中，DD型14例（19.2%），II型30例，ID型29例；对照组43例扩增产物中，DD型5例（11.6%），II型19例，ID型19例，对照组中DD型基因频率低于CVD组，差异无统计学意义（P0.05）。结论：等位基因特异性PCR检测技术可对ACE基因多态性进行有效检测，对于CVD的防治具有重要的参考意义。 【关键词】 等位基因特异性PCR； 脑血管疾病； ACE基因多态性 中图分类号 R743 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2013）34-0042-02 脑血管疾病（cerebrovascular disease，CVD）由脑血管病变所引起，主要高发于65岁以上人群，患者发病后易残留后遗症，导致劳动和生活能力丧失，也是人类死亡的重要原因之一。CVD主要分为缺血性脑血管病和出血性脑血管病，其中以缺血性为多见。CVD的产生由遗传因素和环境因素共同作用所引起，高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病是CVD发生的首要高危因素[1]，而血管紧张素转换酶（ACE）基因多态性与高血压等心血管疾病的发生有关[2]。笔者选择等位基因特异性PCR技术对云南景颇族和傣族73例CVD患者的ACE基因多态性进行检测，以期为ACE基因多态性与CVD的相关性提供临床依据，现将结果报道如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 选取2010年2月-2013年2月云南景颇族和傣族46例健康人员（对照组）和73例CVD患者（CVD组），取早晨空腹静脉血10 ml，肝素抗凝后离心分离血浆，采用酚抽提法抽提患者外周血白细胞DNA模板，所有受检人员无血缘关系。 1.2 试剂与仪器 DNA提取试剂选用天根DP-318 DNA提取试剂盒；Taq master等PCR反应试剂购自天根生化科技有限公司；引物由捷瑞生物工程（上海）有限公司合成，ACE-F，5-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’，ACE-R，5-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’；PCR仪选用Icyclertm thermal cycler（美国Bio-RAD公司）；微量核酸蛋白定量仪选用ND-1000 UV/Vis（美国NanoDrop公司）；凝胶成像系统选用Universal HoodII（美国Bio-RAD公司）。 1.3 方法 1.3.1 模板DNA提取 在全血样品中加入Prok 20 μl，完全混合、离心，再加入GB 200 μl，离心后加无水乙醇，充分混合后过柱，弃滤液，加入TB 50 μl，过柱后回收TB定量，并对DNA样品进行含量检测。 1.3.2 PCR反应体系和反应条件 扩增体系：ACE-F或ACE-R引物1.5 μl，H2O 7.5 μl（样品），2×Taq-master 10 μl，DNA样品1 μl。PCR扩增条件：94 ℃×4 min预变性，94 ℃×30 s变性，67 ℃×30 s退火，72 ℃×30 s延伸，共28～31个循环，72 ℃×4 min延伸后保存。采用凝胶成像系统对扩增产物进行分析，所有样品的PCR实验以及电泳分析均重复两次以上以对结果进行验证。 1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，等位基因频率差异采用字2检验，P0.05），所有样品均经两次以上PCR及电泳验证，条带均清晰且结果一致（图1）。 DL 2000 490 bp（II型） 190 bp（DD型） （ID型）100 bp DNA Ladder 图1 ACE基因多态性等位基因特异性PCR检测结果 3 讨论 脑血管疾病（CVD）是65岁以上人群的常见疾病，当患者脑部出现梗阻性缺血时即发生缺血性CVD，而当脑部血管发生破裂时则为出血性CVD，患者易致残致死，丧失工作或生活能力，危险性极高[3]。有研究表明，脑血管疾病的发生与高血压、高血脂、高血糖、冠心病等心血管疾病密切相关，而ACE基因中由Alu重复序列的存在或缺失的三种基因型（缺失纯合子DD，插入纯合子II，杂合子ID）与心血管疾病的发生有关[4]。因此，鉴于CVD的高发性和危害性，ACE基因多态性的检测