紫贻贝酸性磷酸酶综合性与设计性实验开设.doc

紫贻贝酸性磷酸酶综合性与设计性实验开设 　　摘 要 开设综合性、设计性实验，提高学生的动手能力和创新意识，已成为当前实验教学改革的总体趋势。就中国海洋大学酶工程实验开设的酸性磷酸酶综合性和设计性实验，从选题依据、实验设计安排、实验内容关键点、实验设计心得等5个方面进行介绍。本实验取材经济方便，操作简单易行，适合于东部沿海相关大专院校本科酶学实验教学。 关键词 紫贻贝；综合性实验；设计性实验；酸性磷酸酶 中图分类号：G642.423 文献标识码：B 文章编号：1671-489X（2014）04-0106-03 酶工程是中国海洋大学生命专业生物科学及生物技术专业学生的专业选修课，经过几年的发展，已经形成了学校独特的教学理念及内容。实验教学一直被认为是理论教学最好的补充，是联系理论与实践的桥梁[1]。但由于种种原因，中国海洋大学酶工程实验教学一直处于空白状态。虽然生物化学实验课也开设了有关酶学方面的实验，但远远不能满足学生对于知识的渴求，以及学校加强实践教学的要求。为此，经过反复讨论与实验，为选修酶工程实验的学生开设了酸性磷酸酶综合性和设计性实验。现将相关实验内容介绍如下，希望为相关院校开设综合性及设计性实验提供一些可供借鉴的经验及内容。 1 选题依据 中国海洋大学是一所以海洋和水产为特色的综合性大学，正朝着建设特色显著的高水平研究型大学高速前行。为彰显学科特色，选择海洋生物――紫贻贝作为实验材料。紫贻贝俗称海红、淡菜，是广泛分布于我国东部沿海的一种常见贝类，其肉味鲜美，营养价值高，且价格便宜，成本低。组织学及组织化学研究发现[2]，紫贻贝消化腺中含有多种酶类，又尤以酸性磷酸酶（acid phosphatase EC3.1.3.2，ACP）的活性较高。酸性磷酸酶是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的水解酶，是溶酶体的标志酶，而溶酶体的基本功能是对生物大分子的强烈消化作用，以维持细胞的正常代谢活动。在临床上，酸性磷酸酶测定主要用于前列腺癌等疾病的辅助诊断。因此，对酸性磷酸酶的研究不但对于紫贻贝的养殖有一定的意义，并且对于人体一些疾病的诊断和预防也能起到积极的作用。 另外，实验前期，以紫贻贝酸性磷酸酶分离纯化为主要内容的两项本科生SRDP项目已对紫贻贝酸性磷酸酶的提取、分离纯化及其酶学性质进行了初步的研究，实验过程充分展示了本实验的良好再现性，并且通过验收顺利结题，这也为本实验能顺利开展提供了良好的理论及实践基础。 2 实验设计安排 近几年来，由于教育部《关于进一步加强高等学校本科教学工作的若干意见》中明确提出了“积极推动研究性教学，提高大学生的创新能力，增加综合性与创新性实验”的要求，许多地方高校在其专业实验中不同程度地开设了综合性和设计性实验，但往往两者之间相互独立，自成体系，只能发挥其单一的作用。将综合性和设计性实验有机地结合在一起，不仅能使实验前后连贯，成为一个整体，而且将有助于两者共同发挥作用，起到“1+12”的效果。因此，本实验设计遵从这一原则，在综合性实验后安排设计性实验，设计性实验是综合实验的延伸和拓展，实验前后连贯，构成一个整体。 先用苯酚作出酚标准曲线，然后在35 ℃下，将酶液加入盛有磷酸苯二钠溶液的试管中，精确反应10 min，加入1 mol/L碳酸钠溶液终止反应，再加入Folin-酚试剂，35 ℃精确反应10 min，同时以不加酶液，但反应条件一致的另一试管作为空白对照，测定在OD680 nm下的吸光度。由标准曲线公式计算出样品吸光度所对应的结晶酚浓度，通过相应公式计算酶活力。 蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G250染色法测定。考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595 nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高。 酸性磷酸酶米氏常数Km的测定 测定Km和Vm，特别是测定Km，是酶学工作的基本内容之一。在酶动力学性质的分析中，米氏常数Km是酶的一个基本特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。米氏常数的测定一般通过作图法求得。作图方法很多，其共同特点是先将米氏方程式变换成直线方程，然后通过作图法求得。本实验采用最常用的双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法）求得。 酸性磷酸酶凝胶过滤柱层析 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的一种层析方法。本实验选取葡聚糖凝胶Sephadex G-150作为凝胶填料，用0.01 mol/L醋酸缓冲液作为洗脱液进行凝胶过滤柱层析。 酸性磷酸酶凝胶电泳 酸性磷酸酶凝胶电泳采用SDS（聚丙烯酰胺凝胶）垂直板电泳，浓缩