脊柱侧凸患者髂骨松质骨总RNA提取方法.docxVIP

脊柱侧凸患者髂骨松质骨总ＲＮＡ提取方法赵焕英，殷红，隋雷鸣，赵君朋（首都医科大学医学实验与测试中心，北京１０００６９）摘要：为了创建一种高效提取人体骨组织总ＲＮＡ技术，分别采用Ｔｒｉｚｏｌ、ＲＮｅａｓｙｌｉｐｉｄｋｉｔ及改良ＣＴＡＢ提取人体松质骨总ＲＮＡ，并分别用核酸蛋白检测仪、１％琼脂糖凝胶电泳和荧光Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ检测３种不同方法提取的总ＲＮＡ质量。结果显示，３种方法中，Ｔｒｉｚｏｌ方法提取的总ＲＮＡ纯度最差，ＲＮｅａｓｙ试剂盒提取的总ＲＮＡ纯度得到提高，但完整性差，改良的ＣＴＡＢ方法提取的总ＲＮＡ纯度和完整性符合分子生物学实验要求。改良的ＣＴＡＢ法是从骨组织中提取总ＲＮＡ高效便捷的方法，适于临床骨组织基因表达的研究。关键词：松质骨；总ＲＮＡ提取；ＲＮＡ完整性中图分类号：Ｑ５２２－３３文献标志码：Ｂ文章编号：１００２－４９５６（２０１４）１０－００７９－０４ＡｍｅｔｈｏｄｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｉｌｉａｃｃａｎｃｅｌｌｏｕｓｂｏｎｅｗｉｔｈｓｃｏｌｉｏｓｉｓＺｈａｏＨｕａｎｙｉｎｇ，ＹｉｎＨｏｎｇ，ＳｕｉＬｅｉｍｉｎｇ，ＺｈａｏＪｕｎｐｅｎｇ（ＭｅｄｉｃａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄＴｅｓｔＣｅｎｔｅｒ，ＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００６９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｈｕｍａｎｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅ，ｔｏｔａｌｂｏｎｅＲＮＡｗｉｔｈ３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＢｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒｐｌｕｓ．１％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡｐｕｒｉｔｙｉｓｔｈｅｗｏｒｓｔｗｉｔｈＴｒｉｚｏｌｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｉｎｔｅｇｒｉｔｙｉｓｔｈｅｗｏｒｓｔａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｔｙｉｓｉｍｐｒｏｖｅｄｗｉｔｈＲＮｅａｓｙｋｉｔｓｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｐｕｒｉｔｙａｎｄｉｎｔｅｇｒｉｔｙｗｉｔｈｍｏｄｉｆｉｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｂｏｔｈｓａｔｉｓｆｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．ＴｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄｏｆｔｏｔａｌＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｉｓｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ｗｈｉｃｈｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｏｆｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓｂｏｎｅ；ｔｏｔａｌＲＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ＲＮＡｉｎｔｅｇｒｉｔｙ脊柱侧凸分先天性和后天性两种，后天性中尤其以青少年特发性脊柱侧凸（ＡＩＳ）发病率最高，占全部脊柱侧凸患者中发生率的７４．７％［１］。目前研究认为该病受生长发育、激素分泌、重力等多因素影响，但迄今为止发病机制仍不明确［２－３］。近年来更多的科研工作致力于ＡＩＳ发生、发展的确切的分子机制研究，这就要求能从临床组织标本中提取出高质量总ＲＮＡ（核糖核酸），从而可以开展ＲＮＡ为靶标进行的分子生物学分析。由于人体的松质骨属于成熟的结缔组织，主要由坚韧的基质———胶原、蛋白多糖组成，且松质骨内含有大量造血细胞及脂肪等，富含降解核酸的各种酶分子。因此很难从细胞量少、难于裂解的致密结缔组织中提取出完整和纯净的总ＲＮＡ，限制了对此类组织进行直接研究。所以大多数研究者采用成骨细胞体外分离、培养技术，然后从培养细胞中再提取总ＲＮＡ，或者经过脱钙及切片处理，进行下游不同因子分子水平的实验［４－７］。但这种经过体外培养的骨细胞核酸水平不能真实反映临床机体的基因水平。因此从临床骨标本中提取高质量的总ＲＮＡ技术成为疾病分子水平研究的关键步骤。本文从临床手术中取下的少许松质骨标本（髂骨嵴前１／３的下缘，及脊柱侧凸病变部位的棘突）中提取总ＲＮＡ，并对提取方法进行优化，以提高ＲＮＡ品质。实验试剂、样品及仪器１收稿日期：２０１４－０３－１７基金项目：国家自然科学基金资助项目；首都医科大学校基金技术类项目（２０１４ＪＳ０８，２０１４ＪＳ０６）作者简介：赵焕英（１９７５—），女，北京，硕士，主管技师，主要研究方向为基因表达和调控．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｏｈｙ７５＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ试剂：组织标本保存液ＲＮＡｌａｔｅｒ、ＲＮｅａｓｙＬｉｐｉｄＴｉｓｓｕｅｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ公司）；Ｔｒｉｚｏｌ（ｓｉｇｍａ公司）；ＲＮａｓｅ抑制剂、ＤＮａｓｅⅠ、ＤＮａｓｅ灭活剂（Ａｍｂｉｏｎ公司）；Ｆ