花粉和花药培养.pptVIP

4.花药培养 （1）培养方法 琼脂固体培养法 培养基中加入0.5-0.7%琼脂，呈半固体状态，花药1/3浸入培养基中而不沉没为宜 液体培养法 直接将花药接入呈液体状态的培养基中 注意事项 通气状况 少量加液体培养基成一薄层，使花药浮于液面，与空气接触 加入聚蔗糖，增加比重，使花药不下沉浮于液面上 及时转移沉入底部的长大的愈伤组织，否则会影响再分化培养效果 （2）操作步骤 取材（注意时期） 预处理（高温、低温、N饥饿等） 消毒 无菌接种避免损伤 愈伤1-3mm 胚状体 分化培养基 单倍体植株 三、影响花培成功的因素 有些难培养植物诱导频率很低， 有些植物（裸子植物）至今没有获得真正的花培植株 花药培养虽然是一项成功的技术，但要获得良好的效果，还需克服许多困难 诱导植株成功与否以及诱导频率受多种因素影响 （一）供试材料 1.材料的基因型 材料的遗传背景不同，诱导难易程度不同 茄科番茄、蔓陀罗、烟草易成功 禾本科 水稻优于小麦 亚种 水稻粳亚种(40-80%)优于籼米亚种(2%) 花药培养力是可以遗传的，且为显性或超显性 2.植株的生理状态和年龄 年幼植株花培成功率高 开花始期成功率高 烟草开花始期时花药比开花后期的更易产生花粉植株 烟草开花期第6天，诱导率最高 与植株的营养和生长条件有关 N饥饿高N 水稻高温，高N下，诱导率下降，白化苗提高 3.花粉发育时期 四分体时期 单核期---早、中、晚期 双核期 三核期 是影响花培成败的最关键因素之一 被子植物的花粉发育阶段 高等植物雌雄配子形成过程 不同植物最适诱导期不同 曼陀罗、烟草属、水稻---单核早期、双核期均可诱导，以单核中、晚期效果最好 小麦、玉米---只有单核中期才能诱导 大麦---单核晚期最佳 一般采用单核中-晚期的花粉培养 植物种 减数分裂期 减数分裂前期 四分体 单核期 双核期 成熟期 水稻 小麦 玉米 油菜 番茄 辣椒 拟南芥菜 甘蓝 苹果 葡萄 烟草 不同植物花培的合适花粉发育时期 处于单核期的花粉培养最有利于诱导成苗 ？ ？ ？ 小孢子发育第三期是胚胎形成的临界期，超过了这一时期胚状体就不能形成 在小孢子发育过程，花药内激素水平正在不断改变，由于花药的成熟使激素平衡变得不适合，或为花粉发育所必需的其他一些养分已经耗尽，从而影响了诱导率 培养前应确定花粉发育时期 镜检：醋酸-洋红、I-KI染色（禾本科、茄科）、焙花青-烙矾法（木本、番茄） 利用相应的形态学指标 对于花培没有成功的植物最好选取花粉发育各个时期的花粉进行培养，确定最佳时期 4.材料的预处理 低温预处理 烟草：7-9℃，7-14天 番茄：6-8 ℃，8-12天 水稻：10℃，2-14天 小麦、黑麦：1-3 ℃，2-20天 常温下N饥饿预处理 乙烯、高糖、离心预处理 试验证明，有几种预处理方法能有效提高诱导率 （二）培养基 1.基本培养基 MS应用最多，N6、B5、Nitsch也有应用 不同植物种类，适用的培养基不同 双子叶：Nitsch、MS 十字花科、豆科：B5 水稻等禾谷类：N6 2.碳源 蔗糖应用最广，既是最好的碳源，又起调节渗透压的作用 不同植物种类、不同诱导时期最适碳源浓度不同，通常以2-5%为宜 烟草：2%诱导胚状体 小麦：8-10%愈伤；5-8%分化 水稻：4-6%愈伤；2-3%分化 玉米：12-15%愈伤 3.激素 花粉 愈伤组织 植株 胚状体 植株 脱分化 再分化 关键决定于激素种类、浓度、配比 实例 小麦：2mg/L 2.4-D 愈伤； 2mg/L 胚状体 茄科 高生长素 花粉胚 愈伤组织 愈伤组织 低生长素 低生长素 高生长素 植 株 高细胞分裂素 4.其它添加物 有机附加物 水解乳蛋白 水解酪蛋白 酵母提取物 肌醇 谷氨酰胺等 活性炭（0.5-1%) 吸附了琼脂中不利于细胞生长的某些杂质 吸附了培养基高压灭菌蔗糖产生5-羟甲基糠醛 吸附了激素，降低了激素水平 （三）培养方法和培养条件 1.材料的接种 保证完全无菌条件 注意接种密度 104-105粒/ml为好，花药组织分泌的活性物质相互作用有利于诱导 密度太高，养分消耗太快 密度太低，诱导率下降 2.培养方法 液体培养基近年来较多采用 优点:诱导率显著提高 缺点:有些植物进一步分化困难，白化苗率提高 利用条件培养基也可大大提高培养效率 3.培养条件 温度：最重要，通常24-28℃最适 光照：影响分化途径 花粉 愈伤组织 植株 胚状体 暗 光 光 花粉胚---植株 从花药囊中长出，茎叶细弱，根系不发达，很难直接移栽，需锻炼壮苗 （四）植株的诱导和移栽 愈伤组织---植株 愈伤组织的年龄显著影响分化频率 实 例 小麦水稻 愈伤组织2-3mm 分化率50-