杜仲橡胶颗粒结合蛋白的分离_纯化及抗体制备.docx

杜仲橡胶颗粒结合蛋白的分离、纯化及抗体制备3王敏杰1)韩玉珍2)刘卫平3)傅永福5)(中国农业大学生物学院植物生理学与生物化学国家重点实验室北京100094)赵德刚4)(贵州大学农业生物工程重点实验室贵阳550025)摘要:采用重复漂洗Π离心法分离纯化了杜仲橡胶颗粒,SDS分析发现杜仲橡胶颗粒含有十几种蛋白,其中以56ku、30ku2种蛋白的丰度较高,分别称之为EuRPP56和EuRPP30。对杜仲雌雄株的比较表明,杜仲雌株叶片、雌株树皮及果皮中橡胶颗粒蛋白均是EuRPP30含量高于EuRPP56,而雄株叶片、雄株树皮中正相反。进一步分离纯化了杜仲橡胶颗粒中丰度较高的30ku蛋白,并制备了该蛋白的抗体。免疫细胞化学分析结果表明,在叶片的含胶细胞中有阳性反应,而其它细胞无阳性反应。以上工作为研究杜仲胶粒结合蛋白功能以及阐明杜仲胶生物合成机制奠定基础。关键词:杜仲,橡胶颗粒结合蛋白,抗体制备ISOLATION,PURIFICATIONANDANTIBODYRAISINGOFRUBBERPARTICLEBINDINGPROTEINSFROMEUCOMMIAULMOIDESWangMinjie1)HanYuzhen2)LiuWeiping3)FuYongfu5)(StateKeyLaboratoryofPlantPhysiologyandBiochemistry,CollegeofBiologicalSciences,ChinaAgriculturalUniversityBeijing100094)ZhaoDegang4)(AgriculturalBioengineeringKeyLaboratory,GuizhouUniversityGuiyang550025)Abstract:RubberparticleswereisolatedfromEucommiaulmoidesbyrepeatedcentrifugingandwashing.TheresultsofSDSanalysisshowedthatmorethan10proteinsassociatedwithE.ulmoidesrubberparticles,amongwhich56kuand30kuproteinsweremoreinabundance,wenamedthemEuRPP56andEuRPP30.Theexpressionofrubberparticlepro2teinswasnotthesameinmaleandfemale.InfemaleEuRPP30wasmoreabundantthanEuRPP56,whileinmale,EuRPP56wasmoreabundantthanEuRPP30.EuRPP30waspreparedandpurified.WeraisedtheantibodyagainstEuRPP30.Immun2ofluorecentexperimentsshowedthatthegutta-containingcellscouldbestained.TheseworkslaidthefoundationforstudyingthefunctionoftherubberparticlebindingproteinsaswellasprobingintothemechanismofE.ulmoidesrubberbiosynthe2sis.Keywords:Eucommiaulmoides,Rubberparticlebindingprotein,Antibodyraising杜仲(Eucommiaulmoides)是我国传统的药用植物,也是最具开发前景的温带胶源植物。与巴西橡胶树(Heveabrasiliensis),银胶菊(Partheniumaryentatuim)等积累的顺式-聚-1,4-异戊二烯天然橡胶不同,杜仲胶积累的是反式-聚-1,4-异戊二烯,是天然橡胶的同分异构体。由于结构上的高度有序性,以往杜仲胶只能作为硬橡胶使用,而严瑞芳(1992)发明杜仲胶的硫化工艺后,极大地拓宽了杜仲胶的应用价值。在大部分含胶植物中,如巴西橡胶树,主要在树皮韧皮部的具网络结构的乳汁管中合成橡胶,切割后可分泌出胶乳,胶乳中含有大量包裹有几个到上千个橡胶分子的橡胶颗粒(Dickinson,1969)。银胶菊胶粒在树皮组织普通的薄壁细胞中积累(Cornishetal.,1990)。橡胶颗粒是一类不连续的亚细胞结构,收稿日期:2001-10-10。基金项目:国家自然科学基金和农业生物技术国家实验室开放课题基金(991004-2)资助。31)、2)、3)、4)、5)为作者排序。韩玉珍为通讯作者。林业科学39卷24橡胶分子形成疏水核心,