高效液相色谱总结2.doc

第二部分 实际应用 一：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 一、对起草单位的要求： 1．HPLC法用于药品的有关物质检查或含量测定时，需提供建立HPLC法的依据及参考文献。 2．应对建立的方法进行论证，按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验。 3．建立方法时，应考虑下列事项： ①首选填料为十八烷基键合硅胶，并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验，其中一根为国产柱。 ②流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH值应为7~8；如为酸性药物，流动相的pH值应为3~4。 ③尽可能选用流动相作为溶剂，如未能选用，应说明原因。 ④内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂或对照品，应与待测物质化学结构相似，理化性质接近，峰的响应值相当，以及分离度应大于1.5，另应考虑对照品的来源问题。 ⑤检测器首选UV检测器。 4．采用HPLC法进行有关物质检查时，如杂质峰的响应值与主成分峰的响应值相差太大，应首选自身对照法，而不宜选用面积归一化法。 5．HPLC法用于原料药的含量测定。如以内标法测定含量，应考虑内标物是否含有干扰供试品的杂质；如以外标法测定含量，对照品与供试品应各取样2份，对照晶溶液各进样3次，供试品溶液各进样2次，计算相对标准差（RSD应不得大于l.5％）。 二、对复核单位的要求： 1．按照起草单位提供的色谱条件与方法进行复核。 2．当HPLC法用于有关物质的检查时，应进行最低捡出量试验。 3．应考虑对同一样品分析结果的重现程度、方法的可行性，并作出评价。 Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤 (一)、开机： ??? 1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server程序。 ???? 2、打开 1100 LC 各模块电源。 ???? 3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。 ??? 4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 ?? 5、把流动相放入溶剂瓶中。 ?? 6、打开Purge阀。 ?? 7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。 ?? 8 、设Flow：5ml/min，单击OK。 ?? 9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。 ?? 10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump Control选项，选中Off，单击Ok关泵， 关闭Purge? valve。 ?? 11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：1.0ml/min。 ?? 12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。 ? （二）数据采集方法编辑： ??? 1、开始编辑完整方法： ???? ●从“Method”菜单中选择“Edit entire method” 项，如上图所示选中除“Data?analysis ”外的三项，单击Ok，进入下一画面。 ??? 2、方法信息： ???? ●在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。 ???? ●单击Ok 进入下一画面。 ??? 3、泵参数设定：（以二元泵为例） ????? ●在“Flow”处输入流量,如1ml/min，在“Solvent B”处输入70.0,(A=100-B) ,也可Insert 一行”Timetable” ,编辑梯度。在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 ???? ●? 单击Ok进入下一画面。 ??? 4、自动进样器参数设定: ?????●选择合适的进样方式, 进样体积 1.0ul ,洗瓶位置为6号。“Standard Injection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“Injection with Needle Wash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use injector program”---可以点击Ed