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关于western和酶切的问题
4. Western Blot 定量分析
(1)肾脏组织总蛋白的提取
1)用4℃的0.01M PBS 稀释10×细胞裂解液。取300μl/EP管,标记,置冰上。
2)从-80℃冰箱中取出约50mg冰冻组织,置于液氮中速冻。研磨后移入EP管;
3)每个EP管中加入300(L细胞蛋白裂解液,反复吹打混匀,振荡器振荡15s,冰上静置反应20min;
4)低温快速离心收集管壁残液;
5)用UP200S超声粉碎仪在冰上进行超声粉碎,500Wx30s,以剪切DNA,降低粘稠度;
6)低温(4℃)离心12000转×15min,留取上清;
7)取2(L上清,测定蛋白浓度,其余分装后储于-80℃备用。
(2) 基侧膜蛋白提取:取足量肾皮质于冰蔗糖(250mmol/l蔗糖,5mmol/l tris-hepes,pH 7.4, 0.1mg/ml PMSF)缓冲液,离心1200gx15min;留上层物,离心22000gx15min;将松散的上层悬于蔗糖缓冲液,吹打均匀,并加入Percoll,离心39250gx30min,保留最暗的一层,用KCL缓冲液(85mmol/l KCl, 83mmol/l 蔗糖,2mmol/l tris-hepes,pH7.4)清洗3次,最后将膜蛋白提取物重悬于250mmol/l甘露醇缓冲液(250mmol/l 甘露醇,10mmol/l tris-hepes, pH 7.4, 0.1mg/ml PMSF)。基侧膜成分以Na-K-ATPase活性鉴定,该酶在基侧膜活性比在匀浆中活性可高10倍【50】。
(2)蛋白浓度的测定
1)标准曲线的绘制:将牛血清白蛋白(BSA)标准品用无菌生理盐水稀释成0μl/ml、12.5μl/ml、25μl/ml、50μl/ml、100μl/ml、200μl/ml共六管蛋白标准品。在核酸蛋白测定仪上设定相应的参数,以无菌生理盐水为空白管调零,在仪器上测定上述各管蛋白标准液的A值,然后绘制成标准曲线。
2)样品蛋白浓度的检测:取2μl蛋白样品溶液加入无菌生理盐水98μl中,在仪器上测定A值,根据标准取曲线及稀释倍数即可得出样品总蛋白浓度。
(3)SDS-
1)按Bio-Rad 说明书装好电泳用的玻璃装置
2)灌注分离胶和积层胶:
分离胶
水 1.9ml
30%丙烯酰胺 1.7ml
1.5M Tris –HCL 1.3ml
10%SDS 0.05ml
10%过硫酸氨 0.005ml
TEMED 0.005ml (灌胶前加)
按上述成分和比例混匀,先加分离胶至玻璃缘下2cm 左右(预留梳子1cm 和积层胶1cm 左右),去离子水覆盖。10~20min 待分离胶聚合后,可见凝胶和水层之间明显的界面。
积层胶
水 1.4ml
30%丙烯酰胺 0.33ml
1.0M Tris-HCL 0.25ml
10%SDS 0.05ml 0.02ml
10%过硫酸氨 0.002ml
TEMED 0.005ml (灌胶前加)
灌积层胶:待分离胶聚合后倒掉去离子水,加按上述成分和比例混匀的积层胶。插入梳子,避免气泡混入。放置至凝胶完全聚合。
3)样品准备:2×上样缓冲液和蛋白溶液按体积1:1 混匀,100℃加热10min,瞬时离心。
4)电泳:待浓缩胶完全聚合后,小心拔出梳子,去离子水冲洗梳孔,吸去多余水分。将玻璃板固定于垂直电泳槽中,充满1×电泳缓冲液。按照预定的上样顺序,每样本20μl,上样完毕在剩余的加样孔中加入等体积1×SDS上样缓冲液。积层胶电压90V,待蛋白在积层胶和分离胶交界线压薄后,换成电压140V 至溴酚蓝达分离胶底部,结束电泳。
5)转膜:将与分离胶大小一致的NC 膜100%甲醇中浸泡1min,与分离胶、滤纸垫和海绵垫一起放入预冷的1×转膜缓冲液中15min。按操作说明安装转膜系统:从负极到正极依次为海绵垫、滤纸垫、分离胶、NC 膜、滤纸垫和海绵垫。充满预冷的1×转膜缓冲液,在负极侧放入冰盒,以维持转膜系统温度不致太高。恒压100V,转90min。
6)抗原抗体反应:电转结束后,取出NC 膜,标记正反面后在TBS 中漂洗。
7)丽春红溶液染膜2min,去离子水漂洗,可以看到红染的分子量大小不一的蛋白。TBST 洗去丽春红。
8)5%脱脂奶粉室温下阻断60min,TBST 洗,10min×3 次。
9)孵育一抗:分别加入1:800 一抗稀释液 稀释的兔抗大鼠OAT1多克隆抗体,1:4
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