关于western和酶切的问题.doc

4. Western Blot 定量分析 （1）肾脏组织总蛋白的提取 1）用4℃的0.01M PBS 稀释10×细胞裂解液。取300μl/EP管，标记，置冰上。 2）从-80℃冰箱中取出约50mg冰冻组织，置于液氮中速冻。研磨后移入EP管； 3）每个EP管中加入300(L细胞蛋白裂解液，反复吹打混匀，振荡器振荡15s，冰上静置反应20min； 4）低温快速离心收集管壁残液； 5）用UP200S超声粉碎仪在冰上进行超声粉碎，500Wx30s，以剪切DNA，降低粘稠度； 6）低温(4℃)离心12000转×15min，留取上清； 7）取2(L上清，测定蛋白浓度，其余分装后储于-80℃备用。 (2) 基侧膜蛋白提取：取足量肾皮质于冰蔗糖（250mmol/l蔗糖，5mmol/l tris-hepes,pH 7.4, 0.1mg/ml PMSF）缓冲液，离心1200gx15min；留上层物，离心22000gx15min；将松散的上层悬于蔗糖缓冲液，吹打均匀，并加入Percoll，离心39250gx30min，保留最暗的一层，用KCL缓冲液（85mmol/l KCl, 83mmol/l 蔗糖，2mmol/l tris－hepes，pH7.4）清洗3次，最后将膜蛋白提取物重悬于250mmol/l甘露醇缓冲液（250mmol/l 甘露醇，10mmol/l tris-hepes, pH 7.4, 0.1mg/ml PMSF）。基侧膜成分以Na-K-ATPase活性鉴定，该酶在基侧膜活性比在匀浆中活性可高10倍【50】。 （2）蛋白浓度的测定 1）标准曲线的绘制：将牛血清白蛋白（BSA）标准品用无菌生理盐水稀释成0μl/ml、12.5μl/ml、25μl/ml、50μl/ml、100μl/ml、200μl/ml共六管蛋白标准品。在核酸蛋白测定仪上设定相应的参数，以无菌生理盐水为空白管调零，在仪器上测定上述各管蛋白标准液的A值，然后绘制成标准曲线。 2）样品蛋白浓度的检测：取2μl蛋白样品溶液加入无菌生理盐水98μl中，在仪器上测定A值，根据标准取曲线及稀释倍数即可得出样品总蛋白浓度。 （3）SDS- 1）按Bio-Rad 说明书装好电泳用的玻璃装置 2）灌注分离胶和积层胶： 分离胶 水 1.9ml 30%丙烯酰胺 1.7ml 1.5M Tris –HCL 1.3ml 10%SDS 0.05ml 10%过硫酸氨 0.005ml TEMED 0.005ml (灌胶前加) 按上述成分和比例混匀，先加分离胶至玻璃缘下2cm 左右（预留梳子1cm 和积层胶1cm 左右），去离子水覆盖。10～20min 待分离胶聚合后，可见凝胶和水层之间明显的界面。 积层胶 水 1.4ml 30%丙烯酰胺 0.33ml 1.0M Tris-HCL 0.25ml 10%SDS 0.05ml 0.02ml 10%过硫酸氨 0.002ml TEMED 0.005ml (灌胶前加) 灌积层胶：待分离胶聚合后倒掉去离子水，加按上述成分和比例混匀的积层胶。插入梳子，避免气泡混入。放置至凝胶完全聚合。 3）样品准备：2×上样缓冲液和蛋白溶液按体积1：1 混匀，100℃加热10min，瞬时离心。 4）电泳：待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳子，去离子水冲洗梳孔，吸去多余水分。将玻璃板固定于垂直电泳槽中，充满1×电泳缓冲液。按照预定的上样顺序，每样本20μl，上样完毕在剩余的加样孔中加入等体积1×SDS上样缓冲液。积层胶电压90V，待蛋白在积层胶和分离胶交界线压薄后，换成电压140V 至溴酚蓝达分离胶底部，结束电泳。 5）转膜：将与分离胶大小一致的NC 膜100％甲醇中浸泡1min，与分离胶、滤纸垫和海绵垫一起放入预冷的1×转膜缓冲液中15min。按操作说明安装转膜系统：从负极到正极依次为海绵垫、滤纸垫、分离胶、NC 膜、滤纸垫和海绵垫。充满预冷的1×转膜缓冲液，在负极侧放入冰盒，以维持转膜系统温度不致太高。恒压100V，转90min。 6）抗原抗体反应：电转结束后，取出NC 膜，标记正反面后在TBS 中漂洗。 7）丽春红溶液染膜2min，去离子水漂洗，可以看到红染的分子量大小不一的蛋白。TBST 洗去丽春红。 8）5％脱脂奶粉室温下阻断60min，TBST 洗，10min×3 次。 9）孵育一抗：分别加入1：800 一抗稀释液 稀释的兔抗大鼠OAT1多克隆抗体，1:4