兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白基因在原核系统中的高效表达研究.pdfVIP

生圄童塑量堕堂会生物制品学分会第九次学术研讨会 ·423· 兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白基因在原核系统中的高效表达 王永山1一，陆承平1，周宗安2 (1南京农业大学动物医学院，江苏南京21 0095；2南京军区军事医学研究所，华东医学生物技术研究所，江苏南京210002) L摘要]用分子克隆技术从兔出血症病毒(Rabbit disease virus，RHDV)中国早期 hemorrhagic 流行株NJ85中成功克隆出VP60基因，序列分析表明该基因长度为1 740nt，编码579aa，与已报道 NJ85株VP60基因原核表达质粒pET—VP60，用SDS PAGE分析，重组VP60蛋白的表达量占 菌体总蛋白的40％，分子量约62kDa，在菌体内以包涵体形式存在。免疫印迹试验表明，重组VP60 蛋白与RHDV抗体反应形成一条带，证明它具有抗原性。 [关键词]兔出血症病毒；衣壳蛋白基因(VP60)；表达 兔出血症是由兔出血症病毒(Rabbit Disease Hemorrhagic 性、高度致死性传染病。该病于1984年由中国学者首先发现‘1]，其后在世界其它地区相继发生，迄今国内外 各养兔地区都有存在或流行，给养兔业造成了巨大经济损失。注射疫苗是预防本病最有效的方法，但由于 制备组织灭活疫苗，存在着诸多弊端。因此，应用现代生物技术研制新型疫苗是必然选择，在我国尤其具有实 用意义‘2]。 疫效果“’6’7’8’…，但迄今尚未在生产实践中应用。 基础上，用原核系统进行了高效表达，以探讨重组VP60在新型RHD检测试剂和基因工程疫苗中的应用。 1材料与方法 1．1 病毒、质粒、菌种与试剂RHDV 兔场分离并鉴定，在实验室内接种健康兔传代至今。用该毒株制备的组织灭活疫苗多年用于预防兔出血症。 大肠杆菌(Esehericbia 品)、各种工具酶和生化试剂购自生物技术公司。 1．2 中(Invitrogen(tm)Lifetechnologies)，按该试剂使用方法提取病毒RNA。 1．3 16S亚基3’端互补的核心部分) (MCS)及表达阅读框，同时考虑SD序列(起始密码子ATG上游与rRNA 对表达量的影响，在设计VP60两个扩增引物时，在其5’端各添加一个限制性内切酶位点(引物由大连宝生 +鸣谢：江苏省农业科学院兽医研究所薛家宾研究员为本研究提供帮助与指导，谨致感谢。 ’424‘P—ro—cee-．din—gs—of—9t—h 司产品)克隆，将获得的重组质粒pUC—VP60用限制性内切酶分析鉴定，测序(由上海申友生物技术有限责 任公司完成)，并与已报道的另两个RHDV中国毒株WX84(无锡，GenBankAccession 尔滨，GenBankAccession AF453761)的VP60基因进行同源性分析。 1．4 VP60基因表达质粒的构建取NJ85 VP60基因的克隆质粒pUC 用在设计引物时添加的两种限制性内切酶酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，用UNIQ一10柱式DNA胶回收试剂 盒(Jk海生工生物工程技术公司产品)回收pUC--VP60的1．7kb与pET28b的5．3kbDNA片段，连接两片 段，转化JMl09，涂布于含终浓度为30}tg／ml卡那霉素(kan)的LB琼脂平板上，37C培养14h。挑单菌落，接 VP60，转化BL21(DE3)，进行诱导表达。 37 (DE3)菌以及pETZ8b转化的BL21(DE8)重组菌对照。 值。在A500值1．0时，分别加人终浓度为0．4、0．6、0．8、1．0和1．4 BI．2