蛋白质分离与纯化技术.docxVIP

化工学院生物工程一班 胡冠南 3010207234蛋白质分离与纯化技术蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的/view/2662158.htm生命活动紧密联系在一起的物质。/view/1051481.htm机体中的每一个/view/3687.htm细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。所以研究蛋白质的结构与功能是研究生物科学的基础。蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业中的核心技术。然而该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。所以对该项技术的改良与创新在实际应用中具有重要意义。一．蛋白质分离的准备从正常生物基质中提取各种蛋白质均需要有特定的条件。如果不能满足这一条件，蛋白将很快失去生物学活性，其生物半衰期也将迅速降低。因此，在蛋白质的特性研究中，确定提取条件是一个关键问题。在不同的实验中所通到的困难各不相同，有的困难是如何抵抗外源性蛋白酶的作用而维持蛋白质的稳定，在有些实验中的困难是如何维持酶的活性。在不同的实验中要针对不同的情况来解决不同的问题。然而对蛋白质研究而言却有着一些共同的参数。 缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持—定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。pH和pKa是描述缓冲液的两个重要概念。pH值是指溶液中氢离子浓度的负对数，pH＝-log(H+)。 pKa值是溶液中酸解离常数的负对数值。溶液的pH值与pKa值越接近表明溶液的缓冲能力越强，离pKa值越远则缓冲能力越弱。表1 常用缓冲液的pKa值缓冲液分子量pKa值缓冲范围Trisa12.18.087.1～7.9HEPESb283.37.477.2～8.2MPOSc～7.8PIPESd304.36.766.2～7.3MESe195.26.095.4～6.8　a：三羟甲基氨基甲烷；b：N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磷酸；c：3-（N-吗啉代）丙磺酸；d：N，N’-双（2-乙磺酸）哌嗪；e：2-（N-吗啉代）乙磺酸。※一般原则1）有条件时，应对pKa相近的一些缓冲液进行试验，以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发生不良的相互作用。2）当选定一种缓冲液之后，一般使用其最低的浓度以避免非特异性的离子强度的影响，通常以50mmol/L的缓冲液浓度作为试验起始浓度。3）当缓冲液pKa值的变化超过1个pH单位时其有效的缓冲能力明显降低。而许多酶在极限pH值时往住发生不可逆的变性。4)大多数动物细胞在37℃的生理状况下的PH值为7.0~7.5，而在温度下降至接近0℃时可达8.0。5)要根据所选用的分离方法选用缓冲液：凝胶过滤方法大多数缓冲液均可适用。阴离子交换层折，阳离子缓冲液首选Tris缓冲掖。阳离子交换和羟基磷灰石层析，阴离子缓冲液首选磷酸盐缓冲液。6)混合缓冲液在一定的离子强度下往往具有更宽的缓冲范围。7)所采用的化学试剂应达到试剂级或更高纯度。二．蛋白质的分离、提纯一般程序分离精制蛋白质开始时选择适当的原料，蛋白质的来源无非是天然的材料（动物组织、植物组织和微生物）和基因工程表达产物（大肠杆菌以及其他微生物和动植物细胞）。选择原料的原则是蛋白质含量较高，原料易得。应当注意的是蛋白质含量在种属间有意想不到的差别。当然，基因工程表达产品的原料是限定的，一般来讲，目的蛋白含量都比较高。大多数蛋白质存在于细胞内，结合于细胞器上，所以必须先将细胞破碎，要根据不同情况采用不同的破碎方法。对动物组织可采用磨碎法、超声波破碎法和酶解法。对植物组织可用石英砂等适当的设备及酶解法即能达到目的。生物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液中，可以不必经过抽提直接进行分离。一般的蛋白质需要在细胞破碎后用适当溶剂（如水、稀盐溶液、缓冲液等）将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物得到含有目的物的粗抽提液。从总体上来讲，分离纯化蛋白质在对材料进行与处理后需要用沉淀法进行初步分离，之后再以层析或电泳法得到所需的蛋白质产物。在蛋白质纯化过程中，从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离了天然的环境，受到各种不同试剂的干扰，其结构和功能会受到不同程度的可逆或不可逆的损害。因此，在蛋白质纯化的各步骤都要小心地控制所采用的提纯条件，以避免蛋白质变性。在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）的存在及提纯的情况，即建立蛋白质定量检测方法。三．蛋白质分离提纯的具体方法沉淀法　沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。 　1、盐析法 　盐析法的根据是蛋白质在稀盐