两小时内快速检测结核分枝杆菌及是否利福平耐药.docVIP

精品论文 参考文献 两小时内快速检测结核分枝杆菌及是否利福平耐药 赵立春 (哈尔滨市香坊区结核病防治所 150000) 　　【摘要】目的：研究同时检测患者是否结核，以及是否对利福平耐药，对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性，两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单。 　　【关键词】结核 利福平耐药 Gene xpert检测试剂盒 　　【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）37-0273-01 　　【结果】两个小时内快速检测结核分枝杆菌及是否利福平耐药，经过为时18个月的严格评估，2010年12月8日世卫组织认可Xpert MTB/RIF 作为一种全新的结核病快速检测新方法，世卫组织遏制结核病司司长Maoio Rarig lione博士评价Xpert MTB/RIF检测方法是全球结核病诊断和治疗方法的一个重要里程碑，为患结核病和耐药结核病危险的数百万人带来了新希望。 　　【Gene xpert】是世界上唯一的全自动一体化实时定量PCR检测系统；通过采用实时聚合酶链式反应，全自动医用PCR分析系统能自动完成并整合以下过程；核酸提取，扩增以及目标序列，在单或者复杂样品中的检测，采用一次性特定分析用Gene xpert检测盒制备和处理样本，将样本和所需试剂加入到检测盒中，然后将试剂盒放到一个可用的设备模块之中。 　　材料与方法： 　　1.样本来源：哈尔滨香坊区结核病防治所2013年1月—2013年12月门诊患者。 　　2.主要试剂与仪器：Gene Xpert IV 设备由多达4个模块组成，每个模块处理一个样品。Gene xpert检测盒。 　　方法：样品的准备及核酸的提取 　　被提取核酸的扩增 　　目标序列的检测 　　Cartridge应盒，Cepheid获准专利的完备独立的反应盒，Gene xpert模块是一个独立可控温的荧光计，可对进行中的PCR反应进行实时监测，该模块可快速精准地控制反应样品温度保障反应的快速精准进行；每一个模块都具有四个光谱，这使模块可检测一个反应管中的多种荧光染料；每一个反应单元都相互独立。传统PCR仪器将所有样品都置于相同的同时间、温度、光学程序中，Gene xpert系统中的每一个样品都拥有各自不同的程序，所有待测标本均使用Cepheid公司的Gene xpert检测反应盒按操作说明进行。 　　【原理】Xpert MTB/RIF 核酸检测采用Cepheid公司Gene xpert检测系统。是一种半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，针对rpoB基因81bp利福平耐RRDR区间设计引物，探针，检测其是否发生突变进而用于诊断患者是否结核以及是否利福平耐药（rpoB序列存在突变） 　　【样本处理】 　　1.实验前，打开生物安全柜内的紫外灯，照射台面30分钟 　　2.启动生物安全柜，预运行5分钟，检查安全柜运行是否正常 　　3.用75%乙醇消毒台面，将所需材料置于生物安全柜内 　　4.在Gartridge反应盒侧壁以及相应的前处理管上标上记患者的姓名 　　5.取1ml痰标本置放到有螺旋盖的前处理管中，加入相当于痰标本2倍体积的SR痰标本处理液 　　6.将前处理管剧烈摇动10—20次。或者在涡旋振荡器上震荡20秒左右直至无可见块状痰标本存在，静置15分钟 　　7.打开Cartridge反应盒，使用试剂盒内提供的专用无菌吸管，将取2ml处理后样本由加样孔缓慢加入Cartridge反应盒内。 　　【讨论】突破传统PCR仪的设计，实现更快，更精确，更易操作 　　传统：以PCR仪为仪器平台的分子诊断技术虽然是分子诊断技术中应用广泛并比较成熟的技术，但还是存在一些局限。尽管方法简单，但是操作过程复杂，特别是样品的制备过程，对操作人员的要求很高。很容易被“污染”，PCR技术具有高特异性，高灵敏度的优势，但这些优势也常常成为PCR技术的“烦恼”，环境中的病菌或操作人员的一点失误都会被几何级数的放大，造成检测结果的“假阳性”。 　　美国Cepheid公司首席执行官John Li Bishop先生说到，“Cepheid公司与传统的PCR仪生产商不同，没有经历化学方法到免疫标记法，再到PCR技术这样的发展阶段，而是直接从一个全新的平台上开发PCR仪，在仪器设计理念上突破传统的96孔板设计，采用了独立的反应槽，开创独特的样品制备系统，采用微珠试剂，从样品中核酸的提取到完成PCR检测完全实现自动化的Gene xpert系列。独特的样品制备系统实现了样品制备与测试的一体化 　　传统的PCR实验，需要对样品进行裂解，核酸提取，纯化及浓缩等繁杂的样品制备，通常耗时2-3