微重力条件下胰岛与睾丸支持细胞共培养的实验研讨.pdfVIP

微重力条件下胰岛与睾丸支持细胞共培养的实验研究 孔庆学 汪红 段翠密 李洪波 昊靖芳 韩晓明 王常勇 军事医学科学院组织工程研究中心，北京，100850 vessel 摘要 目的：利用旋转壁或生物反应嚣(rotary、张ll 风xt姗不连续密度梯度法获得纯化胰岛，井通过口rz和AO—PI染色对其进行鉴定．采用消 化分离法获得太鼠睾九支持细胞．低渗处理除去精细胞，井Fa8一L抗体克疲蛆化杂色栓着l其鲍 HE常规染色、免疫纽化、透射电镜、扫描电镜观察细胞复合轴的嫱构．通过葡萄糖刺激实验对 SlCA的生物活性进行检测．蛄果；获得的胰岛纯度为96％，存活率94％，睾丸支持细胞纯度为 95％咀上．在共培养2小时后，胰岛与睾丸支持细胞已开始形成松散的三罐珠形复合物}培养5 天后．复合物较为致密．蛄构稳定。在胰岛与睾丸支持细胞形成的复合物(岛cA)中．胰岛细胞与 睾丸支持细胞随机分布．对胰岛素抗体和FarL抗体染色呈阳性。sICA的葡萄糖刺激指教为 与胰岛细胞随机分布，井具有分蔚瞍岛素的生轴学活性。 关键词 空间生命科学 细胞培养胰岛 睾丸支持细胞 近年来，胰岛移植已成为I型糖屎病的一种重要治疗手段，但免疫排斥反应及移植物功能低下限制 了谈方法在临床的应用．常用的免疫抑制方法是服用免疫抑制荆。但长期服用免疫抑制刺对病人的身 体造成很大损伤．并且很多抑制jfI}奉身对胰岛具有损伤作用．睾丸支持细胞特异的免疫抑制作用及营 养支持作用被人们认识以后，被很多研究者应用于多种细胞共移植实验及临床研究．本文利用旋转氅 式生物反应器模拟的微重力培养条件，共培养大鼠胰岛与皋丸支持细胞形成三维组织样细胞复合物 Cell (Sertoli—lsIets 一、材料与方法 (一)实验材料和试剂 199培养基及胶原酶V购自sigma公司，Dext坤nT40购自Amersham Fas—L抗体购自博士德公司，小鼠抗胰岛素单克隆抗体购自北京中杉金桥公司． (二)胰岛的分离纯化与鉴定 ·10· (三)睾丸支持细胞的分离纯化及鉴定 胶原酶溶液。37℃水浴震荡消化lo分钟．用血清终止消化．200目筛网过滤，o．05唧ol／L1Hs缓冲液作用 5％Cq孵箱墙养两天备用．同时制备细胞爬片进行HE染色和其特异标记物F勰一L免疫染色． Triton l 10min．兔抗大鼠Fas—L多克隆抗体(1 抗为阴性对照．大鼠睾丸切片免疫染色作为阳性对照． (四)胰岛睾丸支持细胞复合物的形成与体外检测 1．旋转壁式生物反应器共培养胰岛与支持细胞 提高转速．同时将2000IEQ胰岛，1×107皋丸支持细胞分别培养于生物反应器中作为对照组【”． 2．sIcA形态学观察 进行HE染色。并在光镜下观察。 3-sICA免疫组化染色 t 一抗分别为兔抗大鼠Fas—L多克隆抗体(1 替一抗作阴性对照。 4．透射及扫描电镜观察SlCA的超徽结构 将SICA用1％四氧化锇固定后．超薄切片。透射电镜和扫描电镜观察复合物表面及内部的超微结构． 5．莓萄糖率9激实验 定胰岛素吉量n]．对照组细胞也进行相同操作． 二、结果 (一)胰岛和睾丸支持细胞的分离纯化及鉴定 纯化胰岛Ⅸrz染色后倒置显徽镜下观察，可见大量表面光滑、不透光、呈鲜红色的胰岛，而未染为红 · 11。 察，可见大部分细胞即活细胞星绿色，少量死细胞呈红色。纯化后的胰岛活性达95％以上(图1B)． 黄色染色，为Fas—L阳性表达(图lD)．细胞纯度在95％以上． 图l胰岛和睾丸支持细胞的鉴定 A．胰岛DTz染色(x n宰丸支持细胞h，一L抗体免疫坦化套色(×200) (二)SI【：A的结构 将胰岛与睾丸支持细胞接种于旋转壁式生物反应器中后。胰岛与睾丸支持细胞会自发聚集生成松 散的结构，培养2h后，球