课件第06章 酶分子修饰 压缩.ppt

聚合酶链反应 (d) 更多轮反应 扩增的片段呈指数增长 30个循环后 产生228=268 435 456个片段 (e) 产物的可视化 PCR产物 DNA大小标准物 琼脂糖凝胶 教案 * PCR实验的基本步骤： (1)94℃模板DNA变性 (2) 50～60℃寡核苷酸引物的退火 (3)72(或74℃)新的DNA合成 (4)重复循环30-35次 PCR（Polymerase Chain Reaction）技术 就是在体外快速扩增特定基因或DNA序列的一种方法。 教案 * 设 定 正 确 的 温 度 变 性 (1min) 退 火 (1min) 延 伸 (2min) 教案 * 温度对引物和模板 的杂交有重要影响 (a) 退火温度太高 (a) 退火温度太高 (b) 退火温度太低 引物与模板仍相互分离 错误杂交 – 不是所有引物 与模板形成正确 教案 * (c) 合适的退火温度 温度对引物和模板 的杂交有重要影响 引物仅与模板上期望 的目的位点相接合 教案 * 用设计的质量不同的引物扩增出来的PCR产物 Lane 1: good Lane 2: nothing Lane 3: wrong size Lane 4: mixture 教案 * 2、易错PCR 易错 PCR（error prone PCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。 连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。 教案 * 3、DNA改组 DNA改组（DNA shuffling）有译为DNA“洗牌”又称有性PCR(sexual PCR)。首先利用DNA 聚合酶的错配进行错误导向PCR 产生随机突变子库,用NaseⅠ或各种限制性内切酶消化父本基因, 产生适当大小的片段, 这些片段再经重新装配、扩增形成的突变文库具有更大的多样性。(这一步可以反复进行多次) ,再扩增和克隆带有多点突变的基因,最后筛选期望的重组子。 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。 教案 * DNA shuffling 采用DNA shuffling 枯草杆菌蛋白酶的抗热性提高了17 ℃,65 ℃的耐热时间提高了200多倍。 教案 * 4、外显子改组 外显子改组（exon shuffling）类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，外显子改组尤其适用于真核生物。 不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。 教案 * 5、体外随机引发重组 体外随机引发重组(random priming in vitro recombination, RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。 教案 * 6、交错延伸 交错延伸(stagger extension process, StEP) 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。 教案 * 7、随机片段交换 该方法主要由三个步骤组成, 即基因破碎; 添加随机短序列; 重新组装。 首先常规PCR 扩增待突变基因。 接着用DNaseⅠ消化, 获得一系列大小在100～300bp 之间的DNA 碎片。 然后在末端脱氧转移酶( TdT) 的作用下, DNA 碎片的3‘ 末端被随意加上一个至几个碱基。 随后这些带3’ 尾巴的短片段互为引物进行PCR 重新组装。 最后加入两端引物扩增出全长基因。 教案 * （三）突变库的高通量筛选 　创建基因突变库的方法目前已有很多,但是建立起来的突变库的容积普遍比我们有能力筛选的蛋白数量要高出几个数量级。 此外,创建基因突变库的方法比较通用,但是对于酶活性筛选却必须针对不同的酶和反应制定不同的筛选方法。 定向进化的最大瓶颈是缺乏通用的高通量的筛选方法,或比较通用的针对目标活性的选择方法。所以高通量筛选日益受到人们的重视。 教案 * 1、定向进化的选择策略 （1）定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类， 降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。 （2）通常,筛选方法必须