His-GILZ原核表达载体的构建及其表达与纯化.pdfVIP

Medical Journal 广东医学2009年2月第30卷第2期Guangdong Feb．2009，V01．30，No．2 ·19l· His—GILZ原核表达载体的构建及其表达与纯化术 王毅飞1，蔡德鸿1△，陈宏1，莫永炎2，伊娜3，邢飞跃4 1南方医科大学珠江医院内分泌科(广州510282)；2南方医科大学病理生理学教研室(广州510515)；3广东省 广州市中医院内分泌科(510130)；4暨南大学组织移植与免疫中心(广州510632) 【摘要】 目的获取糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白(GILZ)的His融合蛋白，为下阶段深入研究GILZ的结 I／Xho 构、功能及筛取与其相互作用的蛋白打下基础。方法利用基因工程技术，BamH I酶切真核表达质粒 HA—GILZ／PcDNA3获得GILZ eDNA，重组于能表达6个组氨酸残基的原核表达质粒pET一30a中。然后用该亚 克隆重组质粒转化大肠杆茵B121(DE3)，用IPTG诱导表达，用Ni“一NTA柱纯化。结果 亚克隆获得GILZ／pET 一30a高效原核表述重组载体，诱导表达的融合蛋白占细菌总蛋白高达40％以上，纯化的蛋白分子量约为24kD。 结论成功构建His—GILZ融合蛋白原核表达载体，并高效表达、纯化，为进一步研究其结构功能关系和临床应用 奠定了基础。 【关键词】 糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白；融合蛋白；原核蛋白；构建；纯化 在细胞和分子水平上对脂肪细胞分化调控机制研 I消化3h，按照非溶胶型DNA回收试剂盒说明书分别 I／Xho 究，对探讨肥胖的疾病过程、预防与治疗具有重要理沦 【口I收，将GILZcDNA砸克隆在经酶切(BamHI) 和实践意义。糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白(slu— 的pET一30a表达质粒中。 eoeorticoidinducedleucine GII7eDNA zipper，GILZ)是D’Adamio HA-Tag TC TAAT．K．,TA姒OG Q掣贬f_Ill 等…在比较地塞米松(DEX)处理和非DEX处理的鼠 l●I_—●●__—_——一CTCGAGm Xh01 B口mHf Xb口l 胸腺细胞mRNA表达差异时，发现的一种亮氨酸拉链 图1 HA—GII．,Z／PeDNA3的多克隆位点及GILZeDNA物理位置图 蛋白家族新成员。该基凶编码137个氨基酸，在脾、淋 巴节、胸腺的正常淋巴细胞中有表达，但在包括肝、脑、 I．3感受态细胞制备及重组质粒的转化将100斗L 肾、肺等在内的作淋巴组织低表达或无表达。除rr在胸 冻存于一70℃的DH5ct感受态菌解冻后，将50ng 腺细胞和外周淋巴细胞，GILZ能被DEX诱导表达，丽且 0．8 GILz在在多种组织如肝、脑肾、肺等可被常用的糖皮质rain，转入42℃水浴90s，加入37℃预温的LBmL， 37℃轻摇45min，接种到含有卡拉霉素(Kan+)的LB 激素类临床药物如地塞米松(DEX)、甲强龙(methyl—