尿多酸肽对耐药急性白血病作用的体外研究.docVIP

尿多酸肽对耐药急性白血病作用的体外研究 沈佳坤 郑林 董慧娟 　　（上饶市人民医院血液科 江西 上饶 334000） 　　【摘 要】目的： 研究尿多酸肽（CDA-2）在耐药急性白血病中的作用。方法：MTT法检测CDA-2对K562及K562/A02细胞增殖的影响，流式细胞术研究细胞凋亡及细胞内阿霉素浓度的改变。结果：CDA-2能显著抑制两种细胞株的生长，呈时间依赖性和浓度依赖性。CDA-2能诱导两种细胞的凋亡，能增加耐药细胞中阿霉素的浓度。结论：CDA-2是一种有前景的逆转急性白血病耐药的药物。 　　【关键词】急性白血病；多药耐药；尿多酸肽 　　【中图分类号】R733,7 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0554-02 　　耐药是急性白血病化疗失败、疾病复发、病人死亡的主要原因。白血病的耐药表现为不仅对一种药物的耐受，而且对不同作用机制的多类药物的耐受，也就是多药耐药。多药耐药形成机制包括细胞内药物排出增多（如多药耐药蛋白P-gp过表达）、细胞解毒作用增强（如GST-pi;过表达）、DNA损伤修复能力增强（如O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶增多）等。其中P-gp过表达是最主要的多药耐药的机制。P-gp是细胞膜表面的一种糖蛋白，它能将细胞内的药物主动“泵”至细胞外，从而减少药物对细胞的毒性作用。如何绕过P-gp的泵作用、逆转耐药，提高白血病的治疗效果是当前白血病研究的重大课题。K562/A02是一种高表达P-gp的多药耐药K562细胞株，它可在含2ug/ml的阿霉素的培养体系中长期生存，是体外研究多药耐药的一个良好的细胞模型。 　　尿多酸肽（CDA-2）是从健康人尿中分离、提取的由多种有机酸和多种小分子多肽组成的水溶液[1]，在MDS中具有诱导原始细胞凋亡的作用。有文献报道[2]CDA-2对急性白血病细胞株（K56-2）细胞有一定的生长抑制作用，但对于耐药急性白血病细胞的效果如何，尚无文献报道。本文利用K562/A02细胞株为耐药急性白血病的模型，研究尿多酸肽对耐药急性白血病的体外效果。 　　1 材料和方法 　　1.1 细胞株及培养条件 　　K562及K562/A02细胞株由本科实验室传代保存。将细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养。K562/A02细胞培养体系中加入终浓度为2mu;g/ml的阿霉素（ADM）以维持其耐性。实验前2周K562/A02细胞培养体系撤除阿霉素。取对数生长期的细胞进行实验。 　　1.2 MTT法检测细胞增殖 　　取对数生长期细胞，调整细胞浓度，以1times;105/ml的终浓度接种于96孔板，加入不同浓度的药物，空白对照组以培养基补足。每孔总体系200mu;l。CO2孵箱内培养24或48小时（h），每孔加MTT工作液20mu;l，置于培养箱内再孵育4h。1000转/分离心，小心吸去上清，加入DMSO 200mu;l/孔，吹打，使紫蓝色甲臜充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度值（A），以时间为横轴，A值为纵轴，绘制生长曲线图。实验重复三次，每次设3个复孔，取平均值为最终结果。按下列公式计算细胞增殖率： 　　细胞生存率=（A处理组-A空白组）/（A对照组-A空白组）times;100% 　　细胞生长抑制率=100%-细胞生存率 　　1.3 AV-PI法检测细胞凋亡 　　细胞以2times;105/ml的浓度接种于6孔培养板，分别加入2mu;g/ml、4mu;g/ml、6mu;g/ml的CDA-2，同时设空白对照。12小时后收获细胞，1000rpm离心5分钟，收集1times;106个细胞。冷PBS洗涤2遍，细胞重悬于100mu;l 1times;Binding buffer，置于流式细胞仪专用试管中。加5mu;l Annexin V FITC和5mu;l碘化丙碇（PI），轻轻混匀，避光室温反应15分钟，上流式细胞仪。 　　1.4 流式细胞术测定细胞内阿霉素浓度： 　　K562/A02细胞以2times;105/ml的浓度接种于6孔培养板，第一孔设为空白对照，不加药物；第二孔加入2mu;g/ml的ADM，第三孔加入6mg/ml CDA-2及2mu;g/ml ADM，培养24小时。收集1-5times;105个细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清。加入适量冷PBS，细胞重悬，1000rpm离心5分钟，重复2次。以冷PBS重悬细胞，上机行流式细胞检测。流式检测激发波长488nm，接收波长575nm.。 　　1.5 统计分析：实验数据均为计量资料，数据之间的比较采用独立样本t检验。所有数据经SPSS11.5统计分析。以Plt;0.05为有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1CDA-2对K56