巨噬细胞与肾结石晶体相互作用细胞基质钙盐沉积的初步研究.docVIP

巨噬细胞与肾结石晶体相互作用细胞基质钙盐沉积的初步研究 吴博 　　（广西医科大学第一附属医院泌尿外科 广西南宁 530021） 　　【摘要】目的 探讨体外U937巨噬细胞与肾结石晶体相互作用的钙盐沉积程度。方法 分组：羟基磷灰石（HAP）组、一水草酸钙组（COM）、混合实验组、空白对照组。茜素红S—氯化十六烷基吡啶钙盐半定量测定晶体-细胞反应后细胞基质的钙盐沉积程度。结果 HAP+COM混合实验组与其它组在相同时段细胞基质的钙盐沉积程度差别有统计学意义，24小时组的程度最高；HAP组与其它组在相同时段差别有统计学意义，与COM组差别无统计学意义。空白对照组与COM组在相同时段差别无统计学意义；各晶体实验组12小时组与24小时组后差别有统计学意义,6小时组分别与另外两个时段组差别无统计学意义;不同实验组不同时段不存在交互作用。结论 HAP可能存在诱导巨噬细胞增强吞噬HAP和COM的作用；巨噬细胞可能通过吞噬HAP后启动吞噬COM。 　　【关键词】巨噬细胞肾结石晶体钙盐沉积 　　【中图分类号】R692.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）12-0390-02 　　近年来的研究发现，细胞-晶体反应是体内肾结石形成的因素，而巨噬细胞吞噬肾结石晶体被证实与肾结石的形成有关联。动物实验已证实肾脏组织中沉积的草酸钙晶体周围包绕着巨噬细胞，但与体外人巨噬细胞的相关研究目前相对较少[1]。因此，本研究探讨体外U937巨噬细胞与肾结石晶体相互作用的钙盐沉积程度。 　　1 材料和方法 　　1.1实验对象：人组织淋巴瘤细胞株U937购自中科院上海细胞库；COM晶体购自索莱宝公司；HAP晶体购自北京德科岛金科技有限公司。 　　试剂：佛波酯购自Sigma公司；茜素红S购自美国MP Biomedicals公司；氯化十六烷基吡啶购自上海晶纯生化科技股份有限公司。 　　1.2建立体外人巨噬细胞模型 　　预先培养U937细胞，加入佛波酯至细胞密度为106个/ml的RPMI-1640培养基，使其终浓度为100ng/ml，置于细胞培养箱以37℃，5%CO2培养12小时后，弃去培养基，用0.01M PBS洗两次，洗去残留的佛波酯及未贴壁的细胞，加入一定量的含10%胎牛血清完全培养基培养72小时[2]。 　　1.3茜素红S—氯化十六烷基吡啶钙盐半定量测定法：分别在3块96孔板诱导巨噬细胞成功后，各分为5组：100ug/ml HAP组、100ug/ml COM组、100ug/ml HAP+100ug/ml COM组、空白对照组及单纯细胞组，每组3个平行复孔,每孔100ul，6、12和24h后，弃上清液，PBS2次，4%多聚甲醛固定20分钟，PBS3次，每孔100ul40mM茜素红S(pH=4.2)溶液，室温50rpm摇床20分钟，PBS、去离子水前后各洗3次，每孔300ul10%氯化十六烷基吡啶溶液（PH=7.0)37℃孵育1h，吸取相应各组上清液200ul，用酶标仪以570nm测量，200ul10%氯化十六烷基吡啶调零，测量未加入茜素红S及肾结石晶体的单纯细胞组样本吸光度b及各孔样本吸光度a[3]。（吸光度测定值c=吸光度a-吸光度b） 　　1.4统计学分析运用 SPSS22.0 统计软件分析，实验数据以均数plusmn;标准差 (x-plusmn;s)表达，采用方差分析，Plt;0.05 为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　茜素红S—氯化十六烷基吡啶钙盐半定量测定法 　　不同时间段及不同肾结石晶体组细胞基质钙盐沉积半定量测定吸光度值（570nm）（见图一）。 　　3 讨论 　　我们之前研究巨噬细胞与肾结石晶体作用，采用定性的钙盐染色法证实细胞基质存在钙盐沉积[4]。对此，我们采用茜素红S—氯化十六烷基吡啶钙盐测定法，能半定量测定钙盐的含量。在近几年的研究中使用表面活性剂如氯化十六烷基吡啶等可使与钙离子结合的茜素红能重新析出和溶解在溶液中进而使用紫外分光光度计测量其吸光值的变化用于半定量的研究判断细胞基质中钙盐沉积的情况从而更准确和量化地研究细胞基质中钙盐沉积情况变化趋势规律[5]。 　　本研究旨在用茜素红检测的方法对巨噬细胞吞噬钙盐肾结石晶体进行定量分析，探讨细胞基质钙盐沉积程度的变化趋势及规律。结果示不同实验组不同时间段不存在交互作用；HAP+COM组与其他组相同时段钙盐沉积差别有统计学意义，24小时组最高；HAP组与COM组差别无统计学意义,与其它组差别有统计学意义。空白对照组与COM组在相同时段差别无统计学意义；各实验组12小时与24小时差别有统计学意义，6小时组分别与其余时段组差别无统计学意义。 　　综上所