凝胶分离法.pptVIP

* 凝胶过滤色层分离法 一．目的要求： 学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。 凝胶过滤法分离蛋白质 二．原理 凝胶过滤即凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)，也称分子排阻层析(molecular exclusionchromatography)，分子筛层析(molecular sieve chromatography)或凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)。 当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。 葡聚糖凝胶（Sephadex ）是最常用的凝胶。 凝胶过滤介质 不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，多孔的网状结构。 常用凝胶： 葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose），聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P）。 凝胶因交联度不同而孔径不同。交联度越大，孔径越小。 蛋白质分子直径 凝胶孔径时，被排阻在外，小于孔径者则进入凝胶。 交联葡聚糖凝胶（Sephadex） 葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。 按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。 Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。 Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。 蠕动泵 记录仪 部分收集器 梯度制造仪 层析柱 检测仪 洗脱液 除盐 选择孔径小，交联度大的凝胶。 Sephadex G-25 全排出的最小分子量为5000 Sephadex G –50 全排出的最小分子量为30000 （除盐的蛋白质分子量必须大于30000，消除凝胶对蛋白质的滞留作用。） 当分子量未知时，选择Sephadex G-25 洗脱时，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大而最后流出，结果使大小不同的物质分离。用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品，logMW对洗脱体积作图 三、器材与试剂 1×20cm层析柱、 葡聚糖凝胶Sephadex-50、 蒸馏水、 三角铁架、 4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、 6mg/ml细胞色素C溶液、 2mg/ml重铬酸钾溶液。 四、实验操作 1、凝胶溶胀 取Sephadex G-50 15g，加500ml蒸馏水室温溶胀一天（或沸水浴中溶胀1小时）。 待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止。 实验操作 2、装柱 取1×20cm层析柱一根，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱下过滤层的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占层析柱内部总体积的1/3时，关闭下端出口。 自顶部缓缓加入Sephadex-50悬液，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，凝胶加至离层析柱顶部约3cm即可。 用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水面)。在装柱过程中，凝胶柱内若有气泡和分离断层现象时，可用玻棒搅动消除这些现象或重新装柱，装柱结束后其凝胶表面应平整 实验操作 3、加样： 取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混合，即为上柱样品。 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面( 不要使平整的床表面搅动)。 打开出口，让样品进入床内，直至样品全部进Sephadex凝胶柱，关紧出口。 滴加蒸馏水使之成2cm水柱 。 实验操作 4、洗脱和收集 调节蠕动泵流速，使得进水速度0.3ml/min。 打开出口，让柱内液体缓慢流出,流速0.3ml/min， (不能让凝胶表面露出水面) 取小试管20支，每管收集1ml，观察两种颜色出现的管号。 实验操作 5、绘制洗脱曲线。 五、注意事项 接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液 装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。 脲酶的凝胶过滤 分离纯化 实验2 实验 原理 脲酶分子量较大