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试验五 血液葡萄糖的测定 福林——吴宪氏法 葡萄糖是一种多羟基醛类化合物，具有还原性，在与碱性铜试剂混合加热时，将二价铜还原为砖红色的氧化亚铜沉淀。 ＋ Cu2+ C O OH Cu2O↓ ＋ 氧化亚铜可使磷钼酸还原生成钼蓝，使溶液呈蓝色。生成蓝色的深度与血滤液中的葡萄糖浓度成正比，从而间接测定葡萄糖浓度。 H3PO4·12MoO3 ＋ Cu2O↓ 钼蓝 钼蓝是钼以混合价态所形成的一系列氧化物和氢氧化物混合型化合物之总称。因呈深蓝色。 钼的平均化合价在5～6之间。用不同的还原方式可以得到不同状态的钼蓝。 由温和的还原剂（如二价锡、二氧化硫、联氨或硫化氢等）还原微酸性的钼酸盐稀溶液时， 得悬胶状的钼蓝；后者用于钼的比色测定。由氢化铝锂还原氧化钼，则得晶体钼蓝， 例如：Mo4O10(OH)2及Mo8O15(OH)6等。 浓度测定——分光光度计 分光光度法：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术. 工作原理 不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.  当一束单色光照射待测物质的溶液时，当某一定频率（或波长）的可见光所具有的能量（hf）恰好与待测物质分子中的价电子的能级差相适应（即ΔE=E2-E1=hf）时，待测物将对该频率（波长）的可见光产生选择性的吸收。用可见分光光度计可以测量和记录其吸收程度（吸光度）。由于在一定条件下，吸光度A与待测物质的浓度C及吸收池长度L的乘积成正比，即A＝ KCL在测得吸光度 A后，可采用标准曲线法、比较法以及标准加入法等方法进行定量分析。 分光光度计用法 调波长到420nm处 开盖调零，关盖调100%（透射比处） 读数（吸光度处） 用完后将盖打开，否则光电管会一直工作，损害较大 实验试剂 1/6mol/L硫酸溶液 葡萄糖贮存标准液 葡萄糖应用标准液 1：4磷钼酸稀释液 碱性铜试剂 10%钨酸钠溶液 抗凝血 磷钼酸试剂 0.25%苯甲酸溶液 实验试剂 实验步骤一、无蛋白血滤液的制备 4.9ml 蒸馏水 0.7ml 全血 0.7ml 2/3N H2SO4 混匀即得血滤液 放置5min,2500rpm离心10分钟,取上清备用. 0.7ml 10%钨酸钠 实验步骤二、光密度值的测定 血糖管 试剂 空白管 标准管 测定管 无蛋白滤液（ml） 蒸馏水（ml） 标准葡萄糖应（ml） 碱性铜试剂（ml） 0.0 4.0 0.0 2.0 0.0（0.0） 0.0（1.0） 4.0（3.0） 2.0 4.0 0 0 2.0 取四支血糖管按下表操作： 混匀，置沸水浴中煮8分钟，取出，用流动自来水冷却3分钟（切勿摇动血糖管） 磷钼酸试剂（ml） 2.0 2.0 2.0 1：4磷钼酸溶液加至 25 25 25 混匀后放置2分钟（使二氧化碳气体逸出） 1：4磷钼酸溶液加至25刻度处后，用塑料塞住管口颠倒混匀，用空白管调“0”点，在420nm波长处进行比色，读取各管的光密度值。 实验步骤三、计算葡萄糖含量 测定管光密度值 标准管光密度值 测定管浓度 标准管浓度 按以下公式计算葡萄糖含量： 注意事项 1、无蛋白滤液制备： 加入硫酸、钨酸钠试剂时要一滴一滴地加，边加边摇，使血液中蛋白质充分变质。 所用方法是将原来样品稀释10倍，因此1ml无蛋白滤液相当于0.1ml的全血。 1、加磷酸钼试剂之前，溶液要充分混匀，待水沸腾后，精确煮沸8分钟，沸水浴中加热过程中不要摇动，冷却时也切勿摇动血糖管。---避免生成的亚铜被氧气再氧化。 3、先加入磷钼酸2.0ml，再加入1：4的磷钼酸溶液至25ml，加样时注意不要加错。 4、分光光度计使用时需预热20分钟以上。 5、实验过程中不要调节波长，造成其它组测定时出现错误。加入磷酸钼试剂后显色并不稳定，故应迅速进行比色。