麋鹿皮肤成纤维细胞的细胞周期同步化研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 麇鹿皮肤成纤维细胞的细胞周期同步化研究 赵雪萍1王锋11孙永成1王子玉1丁晓麟1武杰1丁玉华2 (1．南京农业大学动物胚胎工程技术中心江苏南京210095； 2．江苏大丰麇鹿国家级自然保护区，江苏大丰224136) 摘要：供体细胞和受体胞质的细胞周期对体细胞核移植的成功率有着至关重要的作用，通常认为 GO／G1期的体细胞最适宜用作核移植的供体。为了在核移植过程中获得更多的GO／G1期供体细胞， 本试验对麋鹿皮肤成纤维细胞进行不同汇合程度、血清饥饿不同时间以及(mimosine)不同剂量和 时间的处理，利用流式细胞仪分析细胞周期。结果表明，100％汇合的细胞GO／G1期比例可达91．95 聚集的比例会增加；适宜剂量的含羞草酸能够使麋鹿成纤维细胞的达到同步化的目的，但同时也会 对细胞造成损伤。 关键词：麋鹿；成纤维细胞；细胞周期同步化；接触抑制；血清饥饿 体细胞克隆技术已经在绵羊n1、小鼠瞻羽、牛Ⅲ、山羊腩3、和猪埔3等动物上取得成功，核移植的 供体细胞状态对克隆效率有着非常重要的影响。资料表明，失活并处于GO或Gl期的二倍体细胞有 利于细胞周期的协调和供体核的重构。使细胞周期同步化于G0或GO／G1期常用的方法有血清饥饿和 细胞汇合后延长培养时间。除此之外，还有几种化学物质能够有效地将细胞周期阻滞于不同的阶段， 可以获得比例很高的GO／G1期细胞，并且细胞凋亡比例也很低憎。，而含羞草酸能够使细胞周期阻滞 于G1期晚期，此时DNA合成还未开始憎1。 麇鹿是我国一级野生保护动物，与大熊猫一样，素有“活化石”之称，具有重要的研究价值。 但由于历史变迁与生活环境的破坏，以及自身繁殖速度较慢，致使现有的麇鹿数量非常有限。异种 核移植技术的深入研究为保护濒危珍稀动物提供了新的思路和研究方向。为了给麇鹿异种克隆提供 更多的GO／G1期细胞，我们对不同汇合程度、血清饥饿不同处理时间以及含羞草酸不同处理剂量和 时间的麇鹿成纤维细胞进行研究，并用流式细胞仪分析处理后细胞的细胞周期。 1材料与方法 1．1麇鹿皮肤成纤维细胞培养 对麇鹿进行飞管麻醉，刮毛后用灭菌耳号钳打下耳尖两块皮块，用1％新洁尔灭冲洗后迅速投 剔去软骨和脂肪，剪成约l衄3大小的碎块，PBS洗涤后均匀铺瓶，4h后加入培养液。每2d换液 一次。培养条件为37C、5％c02、饱和湿度【101。细胞长成致密单层后，用胰酶轻度消化，连续传3～ 4代后获得纯化的成纤维细胞。本试验所用的细胞为第8代麇鹿皮肤成纤维细胞，调整接种时的细 胞密度为3x103个／IIll。 1．2细胞处理 实验研究麇鹿成纤维细胞在不同生长状态以及不同处理方法的细胞周期特征。 · f基金项目】：江苏省自然科学基金(BK2003075)资助。 【作者简介】：赵雪萍(1980一)，女，山东省莱阳人，硕士，主要从事哺乳动物胚胎工程研究工作 1【通讯作者】：王锋(1963一)，博士，教授，博导，主要从事动物胚胎工程研究。Email：fwan92001@sina．com 439 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 的DMEM中培养。 处理24h。含羞草酸处理后，一部分细胞直接用流式细胞仪检测，另一部分细胞再加入无含羞草酸 的培养液继续培养24h。 1．3用流式细胞仪进行细胞周期分析 然后用流式细胞仪分析。 2试验结果 2．1不同汇合程度的细胞周期分析 表1不同汇合程度的细胞周期分析 Table1Thecell atdifferentconditions cyclestages growth 周期特点，如表1和图1所示，结果表明：随着汇合程度增加，细胞周期中GO／G1期细胞比例也增 胞的比例高达95．85％。 2．2血清饥饿不同处理时间的细胞周期分析 表2血清饥饿不同处理时间的细胞周期分析 Table2 Theeell atdifferentserumstarvation stages