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羽毛肽螯合锰的鉴定及制备工艺研究 单春乔 刘秋晨 孙远芳 韩雪冰 宋蕙男 王杲强 高鑫 刘艳 大连三仪生物工程研究所 瓦房店市动物卫生监督所 瓦房店市农业综合行政执法大队 江苏三仪科研质量控制中心 X 关注成功！ 加关注后您将方便地在 我的关注中得到本文献的被引频次变化的通知！ 新浪微博 腾讯微博 人人网 开心网 豆瓣网 网易微博 摘????要： 试验以羽毛粉经角蛋白酶酶解制得的羽毛低聚肽水解液与水合氯化锰为原料, 合成羽毛低聚肽螯合锰, 通过红外色谱法分析螯合物的状态, 通过单因素试验筛选和响应面试验优化合成工艺条件, 结果表明, 温度、质量比和p H值对螯合率影响较大, 羽毛低聚肽螯合锰的最佳制备条件为质量比1.2∶1、反应温度65℃、反应p H值6.6和反应时间30 min, 在此条件下, 锰离子的螯合率为9.16%。 关键词： 羽毛低聚肽; 螯合; 反应条件; 作者简介：单春乔, 硕士, 中级工程师, 研究方向为生化与分子生物学。 作者简介：刘艳, 博士, 高级兽医师, 研究方向为分子生物学和食品科学。 收稿日期：2017-10-23 Received： 2017-10-23 锰是生物机体内重要的阳离子, 是调节细胞内外钙、钾和钠平衡的重要离子。锰参与生物机体内所有的能量代谢, 是ATP酶所必需的辅助因子, 能催化或激活300多种酶体系。机体缺锰会导致一系列生理功能紊乱, 如影响酶的代谢, 改变细胞膜的通透性, 加速钠、钾和钙依赖泵能量的消耗, 加快细胞内钙的贮存及导致细胞坏死等。因此, 在动物科学领域中锰具有很重要的生物学及营养学价值。 目前, 在饲料生产和临床应用方面, 锰制剂的添加大致有3种类型:无机锰、氨基酸锰和有机酸锰盐。不同类型的锰制剂对动物机体的临床效果及生物学功能存在显著差异[1-2]。国内外大量研究结果证实, 有机锰制剂的应用效果远远高于无机形式的锰制剂添加剂[3]。羽毛中的蛋白质含量较高, 经特殊工艺处理的羽毛粉可制备出利于动物体吸收利用的小肽, 通过将具有多种生理功能的多肽与锰盐进行螯合, 提高锰元素在机体的吸收和利用效率, 研制出具有双重营养功能的饲料添加剂———多肽螯合锰饲料添加剂。关于混合蛋白肽和某些氨基酸与金属盐螯合物的工艺条件有学者进行过报道, 但对于羽毛低聚肽螯合锰的制备方法未见报道。 1 材料与方法 1.1 试验材料 氢氧化钠、氯化锰和无水乙醇 (分析纯) 。 1.2 螯合物中锰含量的测定 采用EDTA络合滴定法[4]。 1.3 锰离子螯合率的测定 锰的螯合率=螯合的锰元素含量/总的锰元素含量×100% 1.4 羽毛低聚肽螯合锰的制备方法 量取一定浓度的羽毛低聚肽溶液, 加入准确称量的氯化锰, 待氯化锰充分溶解后, 用氢氧化钠和盐酸溶液调至相应反应所需的p H值, 在固定温度下反应一段时间。冷却后, 用8倍体积的无水乙醇洗涤沉淀, 抽滤, 抽干后置于干燥箱 (60℃) 中烘干, 得白色粉末。 1.5 螯合物红外色谱分析 按照FT-IR光谱表征 (Bruker公司的Tensor-27红外光谱仪) 将样品按质量分数1∶30的比例与溴化钾充分混合, 并进行研磨压片, 以纯溴化钾片的谱图做参比, 在室温下扫描记录样品的谱图, 扫描范围为400~4 000 cm, 检测精度为4 cm, 扫描次数为32次。 1.6 羽毛肽螯合锰离子最优条件响应面优化 响应面分析法 (RSM) 是以回归方程作为函数估算的工具, 确定各因素及其交互作用对试验指标的影响, 能够精确地表述各因素和响应值之间的关系。根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理, 选取质量比、反应p H值和反应温度为响应面分析试验因素, 分别以A、B和C表示, 试验因素和水平设计见表1, 使用Design-Expert软件进行BoxBehnken设计。 表1 响应面分析因素及水平设计 ?? 下载原表 2 结果与讨论 2.1 羽毛低聚肽螯合锰的红外分析结果 红外光谱法是研究螯合物的重要方法。从图1可见, 大豆肽在1 662和1 556 cm处出现明显的振动峰, 分别归属为酰胺键中C=O伸缩振动峰 (酰胺I带) 和N-H的弯曲振动峰 (酰胺II带) 。锰与肽形成复合物后与大豆肽相比, 除保留酰胺键的振动峰外, 红外光谱曲线也发生改变, 主要表现在:螯合反应后红外光谱曲线在3 072和1 451 cm处的特征吸收峰消失, 这与文献中制备猪血多肽铁螯合物的研究表现出相似的趋势, 因此可以断定该大豆肽与锰离子已形成锰肽螯合物。 图1 螯合物的红外谱图 ??下载原图 2.2 羽毛低聚肽与锰离子的质量比对螯合率的影响 反应条件:反应温度为55℃, 反应时间30min, p H值为6.0。羽毛低聚肽与锰的质量比对螯合反应的