原代细胞培养和细胞实验设计(陈加祥).pptVIP

注意事项 1. 抽血后在2小时内使用。 2. 注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在聚蔗糖液面上，避免破坏其界面。 3. 在收集单核细胞和淋巴细胞时，将吸管轻轻插入该层后，沿管壁轻轻旋转吸取细胞。 2、组织块培养法（组织培养） 举例：贴块法培养血管平滑肌细胞 步骤： 铺瓶： 大鼠经颈动脉放血后，无菌操作取一段胸主动脉，置于含Hank‘s液的平皿中漂洗3次，将血凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层，纵行剪开血管，刮血管内膜2~3遍，将中膜剪成约1 mm2大小碎片，均匀铺在瓶底，25 mL培养瓶可接种20~30小块。 轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃温箱内。 翻瓶：待其稍干燥后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养。 培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液。 7-9天开始有细胞从组织块周围爬出 14天左右细胞融合成大片 3. 消化法原代培养HUVEC （1）无菌条件下取正常分娩胎儿的新鲜脐带(20 cm)，用PBS冲洗脐带至无血色液体流出。 （2）从脐静脉一端注入0.1%的Ⅱ型胶原酶溶液，夹闭脐带两端，置于37℃培养箱消化。15 min后，收集消化液，并加入含20％胎牛血清的M199培基10 ml终止消化，注入M199培基反复灌洗脐带，收集冲洗液，与消化液一起于1000 rpm离心5 min。 （3）弃上清液，加入全M199培养液（含20%胎牛血清、100 ng/ml VEGF）4 ml，吹打使细胞重新悬浮，移入培养瓶中，静置培养。 （4）24 h后换液，以后每隔3天换液一次，约7天左右细胞长满汇合，可以传代。 （5） 使用前运用标记因子CD31或VIII因子对内皮细胞进行鉴定。 四、培养细胞的纯化 1、自然纯化 2、人工纯化 （1）酶消化法 （2）机械划除法 （3）反复贴壁法 （4）克隆法 （5）培养及限定方法 （6）流式分选 1、自然纯化 即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。 无法人为选择细胞，时间长 有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。 2、人工纯化 （1）酶消化法 如上皮细胞和成纤维细胞对胰酶的耐受性不同：消化细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而采用多次差别消化法将上皮细胞和成纤维细胞分开。 （2）机械划除法 上皮细胞和成纤维细胞同时出现，混杂生长。每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。 （3）反复贴壁法 成纤维细胞与上皮细胞相比，贴壁快，大部分细胞常能在短时间内（约10-30 min）完成附着，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。 （4）培养基限定方法 某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞： 溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。 血清浓度，上皮细胞耐受低血清环境的能力较强，而成纤维细胞的耐受力较差，利用这个差异，用含1.5%小牛血清的培养液可以降低培养物中成纤维细胞的生长。 （5）克隆法 采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，选择出所需要的克隆。 （6）流式分选 第二节、细胞实验设计 例如：p53调控NGFR基因转录 原代细胞的培养 细胞实验设计 陈加祥，Ph.D 第一节、原代细胞培养 基本概念： 来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系（Cell Line） 。 —能够连续传代的细胞叫做连续细胞系 —不能连续培养的称为有限细胞系 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株（Cell Strain） 。 原代细胞的培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步。 原代细胞生物学特性未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性。 原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂。 原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。 （4）去除材料上的血液、脂肪、坏死组织及结缔组织； （5）尽量选用易培养的组织进行培养。胚胎组织易于成熟个体组织，分化低易于分化高的组织，肿瘤组织易于正常组织。 二、原代细胞的分离和制作 1、悬浮细胞的分离方法 组织来源：血液、羊水、胸水或腹水。 方法：1