原位杂交2.ppt

原位杂交技术;基因过表达的检测:;基本原理;原位杂交组织化学原理;分子杂交的特异性强、灵敏度高，同时又有组织细胞化学染色的可见性。 既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究。 所需样本量少，可用与活组织细针穿刺组织。 应用范围广泛，可对特定的基因DNA、mRNA的表达进行定位、定性、定量。;DNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针;放射性标记：标记物为放射性同位素，敏感性高、特异性好，但对人体有伤害性。 非放射性标记：生物素、地高辛、荧光素、酶类。;地高辛标记物;根据探针标记物是否能直接被检测到， 分为： 1 直接法：标记物为放射性同位素、酶或荧光 2 间接法：标记物为半抗原，如地高辛（DIG）或生物素(biotion);杂交前准备 杂交 杂交后处理 显示;1 固定：保持细胞形态结构,最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平. 最常用多聚甲醛固定组织(不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,不会影响探针穿透细胞或组织) 2 玻片的处理：多聚赖氨酸液、APES;3 增强组织通透性： 方法:去垢剂、Triton-100、某些消化酶（如蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶或淀粉酶等） 作用:这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的通透性,提高杂交信号. ; 注意:在增强组织的通透性的同时也会降低RNA的保存量和影响组织结构的形态.因此用量及孵育时间上应谨慎掌握 ;4 防止RNA酶的污染 原因:手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNA酶 措施:在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套,所有实验用玻璃器皿及镊子都应与实验前一天置于高温(180℃)烘烤,以达到消除RNA酶的目的.; 杂交是将杂交液滴加于要检测的组织或细胞片上，加盖硅化的盖玻片，为了防止杂交液的蒸发，可在盖玻片周围用rubber cement封固，时间为12－20h。温度为37℃-52℃. ;注意:如果探针为双链DNA探针,则杂交前应有变性这一过程. 方法:分开变性 共同变性(应用原位PCR仪或原位杂交仪);目的：去除过剩的探针，减少非特异性信号。 方法：采用高盐浓度漂洗, 减少探针与组织静电结合。 注意: 漂洗的过程中切勿使切片干燥.;同位素标记：采用放射自显影检测 生物素标记：采用ABC、SP等免疫组化方法检测 地高辛标记：采用anti-DIG-HRP-DAB检测系统 荧光标记：荧光显微镜观察 酶标记：底物直接显色;人类表皮生长因子受体-2(HER2)是一种受体型的酪氨酸激酶,它在20%-30%的原发性乳腺癌中有基因的异常扩增和蛋白的过度表达. 赫赛汀是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体,适合于治疗HER-2过度表达的乳腺癌.;显色原位杂交（CISH） 检测HER-2基因的扩增水平 ;乳腺癌标本先经过IHC的检测,IHC 3＋者可接受赫赛汀治疗,IHC 2＋者需接受CISH/FISH的检测,有基因扩增者可接受赫赛汀治疗. IHC 3+或CISH/FISH阳性能最大获益.;显色原位杂交（CISH)在福尔马林固定石蜡包埋的组织中使用地高辛标记的探针进行杂交反应，再用鼠抗地高辛－抗体和辣根过氧化物酶－抗鼠抗体进行免疫结合，最后DAB显色，CISH监测HER-2基因信号在普通亮视野显微镜下观察。近年来国内外许多文献报道乳腺癌中CISH与FISH的符合率为93.8％～100％。 ;CISH与FISH优点：1、基因异常与组织形态学可以同时显示；2、无需特殊设备，普通光学显微镜即可观察结果，切片可以长期保存；3、结果分析快速、简便，操作过程简单，检测成本低。缺点：CISH检测多种颜色信号较为困难，无法精确计算拷贝数。 ;CISH操作流程：;Ⅰ 预处理;Ⅰ 预处理 3.脱蜡至水 4.加热预处理（热处理缓冲液加热达到98～100℃时放入组织切片，保持15分钟 ）;Ⅰ 预处理;Ⅱ 变性和杂交 如果有原位杂交或热板，一般采用共同变性和杂交。 1、滴加探针：杂交膜中央滴加足够的探针(13～15μl) 将杂交膜轻盖在组织上，避免产生气泡，用封片胶 密封杂交膜的边缘。 2、加好探针的切片放在原位杂交仪或原位PCR仪中 95℃ 变性5分钟 37℃ 暗盒孵育过夜（至少要超过12小时）;Ⅱ 变性和杂交;Ⅲ 严格洗涤 杂交后，小心去除封片胶和杂交膜 严格洗涤：SSC，室温下片刻 SSC，75℃，5分钟 （超过1张切片，每多加1张切片，温度应提高1℃， 但是最高不要超过80℃） ;Ⅳ 免疫显色 室温下滴加3％H2O2甲醇溶液10分钟 PBS/Tween 20（0.025％）冲洗2分钟×3次 室温下滴加封闭液封闭10分钟 去除多余封