答辩幻灯 程志强.ppt

二维电泳 分别取适量两组混合血清，用Bradford法进行蛋白定量, 再用水化液调整到1μg/μl后上样，蛋白质上样量1mg。先做预实验经PDQUEST2-DE软件分析发现胶图分辨率可以接受，遂未做血清高丰度蛋白去除处理。 操作严格按照Bio-Rad公司双向电泳实验操作手册进行。采用IPG 预制胶条17cm pH值3- 10。开始电泳，梯度升压, 等电聚焦总伏小时为100kVh。平衡后胶条转移至12.5%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS- PAGE)上进行第2相电泳。16℃恒温, 采用恒定功率电泳, 开始时2.5W/gel, 1小时; 再用15W/gel至溴酚蓝到达凝胶的底部边缘。每组实验重复三次。 毛细管液相色谱-电喷雾离子源-串联质谱（Cap LC-ESI-MS/MS）全自动分析 将经二维电泳分离考马斯蓝染色PDQUEST2-DE软件确定的差异蛋白质斑点用刀片切下，切成1平方厘米的胶块，置于Eppendorf管中，用100微升50%乙晴-100mmol/l碳酸氢铵洗2~3次，每次20分钟，至胶粒完全脱色。脱色后的胶粒置于真空干燥器 (Speed Vac Savant Instruments USA)中干燥20分钟，加入5~10微升10mg/l的胰蛋白酶液（含25mmol/l碳酸氢铵溶液，PH8.0）,置4摄氏度冰箱防治40分钟，补加10微升25mmol/l碳酸氢铵缓冲液，37摄氏度温育过夜。50~100微升50%三氟乙酸40摄氏度提取酶切肽段，一小时一次。用相同体积的50%丙烯晴-2.5%三氟乙酸溶液于30摄氏度提取，一小时一次。50微升丙烯晴超声提取一次。合并3次提取液，用真空干燥器 (Speed Vac Savant Instruments USA)进行干燥。用3~5微升0.5%的三氟乙酸溶液溶解干燥后的蛋白样品，取1.5ml样品置于Cap LC-ESI-MS/MS全自动分析仪的自动进样管中脱盐，脱盐后的样品进入C18毛细管柱进行肽段分离, 分离后的肽段直接进入离子源, 对于每一个强度超过阈值的肽段(一般为主峰强度的10% ) 都自动进行M S/M S 测定。测定后的数据经ProteinLynx 2.0 (Waters) 软件处理，通过Mascot()查询NCBI数据库进行蛋白质鉴定。搜索参数设置为：数据库为NCBInr, 酶为胰蛋白酶, 允许漏切位点为2，母离子误差范围± 1.2 Dalton, 碎片离子± 0.5 Dalton。 酶联免疫吸附试验 ELISA分析 用双抗体夹心酶标免疫分析法测定样本血清中Apo A-I的含量，严格按瑞典Mabtech AB公司Human ApoA-I ELISA Kit说明书进行。用2μg/ml的鼠抗人ApoA-I单克隆抗体包被微孔板，制成固相抗体，再往包被单抗的微孔中依次加入ApoA-I抗原、生物素化的抗人ApoA-I抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺（TMB）显色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），同时用试剂盒中提供的标准品制作标准曲线，根据样品的OD值用标准曲线计算样品浓度。 统计方法 采用SPSS10.0软件 两组均数之间的比较用成组设计资料的t检验 多组均数之间的比较用单因素方差分析。 应用二维电泳、液相色谱串联质谱技术筛选前列腺癌骨转移相关血清蛋白 硕士学位论文答辩 导师: 李 鸣 学生: 程志强 2009年5月26日 恩师: 李 鸣 1992 德国美茵兹大学医学博士 1998-2001 美国休士顿MD Anderson 肿瘤中心工作学习 2001年任美国休士顿Baylor医学院助理教授 2003-2007年任北京大学泌尿外科研究所副所长 2007.7-现在 北京肿瘤医院泌尿外科主任 中华医学会泌尿外科分会肿瘤学组副组长兼秘书长，《中国前列腺癌诊断治疗指南》主编?，中国前列腺癌协作组组长 程志强 简历 1991-1996 北华大学医学院 临床医学 本科 预备党员、通过英语CET-4、体育部长… 1996-2006 吉林油田职工医院 住院医师 主治医师 2006-2007 北京大学医学部 硕士研究生 2007-2009 北京大学肿瘤医院 泌尿外科 硕士研究生 《肿瘤防治研究》发表论著一篇 流行病学Epidemiology 前列腺癌流行病学 世界范围内第二常见恶性肿瘤 明显地理和种族差异:亚洲低,欧美高 黑人高 我国2002年标化发病率为1.6/10万,发病率逐年升高: 上海 1973-1975 1.8/10万 1997-