07 免疫组化的特异性与敏感性.pptVIP

第七章. 免疫组化的特异性与敏感性 (The specificity and sensitivity of Immunohistochemistry) I. 特异性 A. 方法特异性: 说明染色结果是由免疫组化反应引起的. B. 血清特异性: 说明染色结果指由抗原抗体反应引起, 即要证明抗原被染色, 又要排除交叉反应问题. II. 特异性与非特异性染色: A. 特异性染色: 由一抗与待检抗原发生特异性免疫反应而产生的染色. 新发现的阳性结果需多次多方法重复实验证实. B. 非特异性染色: 由组织细胞中非抗原-抗体反应引起的染色, 常无结构基础并弥漫存在, 或多次染色的结果相互矛盾. 常见于组织切片的边缘 (边缘效应)或人工损伤部位, 可干扰对特异性染色的观察和记录. ;;IV. 提高敏感性的方法 A. 增强特异性染色: 1. 选用敏感的方法: 选用PAP法, ABC法和免疫金银法等敏感的方法, 增加抗原上标记物数目, 增加免疫反应产物的量. 2. 增加抗体孵育时间: 高稀释度一抗4℃过夜而非室温2小时. 也可以增加二抗和终抗的孵育时间. 3. 重复抗体或检测试剂层数: a. 重复一抗: 一抗孵育后彻底清洗后再用一抗孵育. ;4. 增加抗原与抗体的接触: 蛋白酶消化, 抗原修复和提高抗体和检测试剂对组织的穿透力. 5. 加强DAB反应产物的着色: a. 锇化: DAB显色后用0.01~1%四氧化锇处理30秒出现棕黑色. 锇化后可用于EM观察. b. 镍加强法: 在0.05%DAB-0.01%H2O2显色液10ml中加50?l 8%的氯化镍(Nickel chloride, NiCI2). DAB反应产物呈紫蓝色. c. 钴镍加强法: 100mg DAB溶于200ml 0.1M, pH7.3的PB中, 逐滴加入5 ml 1%氯化钴(Cobalt chloride, CoCl2), 然后再加4 ml 1%硫酸镍铵(Nickel ammonium sulfate, NiSO4·(NH4)2SO4·6H2O), 孵育切片10~15分, 反应产物为黑色且电子致密. d. 咪唑(Iminazole)加强法: 在DAB显色液中加10mM咪唑(用1M HCl调pH至7.6), 反应产物棕红色. ;小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase)阳性神经元, ABC法染色, DAB-H2O2-硫酸镍铵显色. 1994. ABC-HRP-DAB-Ni. Anti-Contactin1. Neuron.;;B. 背景染色的来源及消除方法: 1. 固定失败: 细胞内抗原位移甚至扩散而引起背景染色. 二甲砷酸缓冲液也易引起背景着色. 2. 染色过程中切片干燥: 造成严重的非特异性染色且难以处理, 应尽量使用湿盒. 3. 内源性酶活性: 内源性酶如脑组织, 巨噬细胞和粒细胞等的过氧化物酶或红细胞等的铁卟啉(Ferriporphyrin)的假过氧化物酶可导致假阳性, 特别在冰冻和振动切片. 可在加一抗之前用0.3%H2O215~30分消除. 若处理破坏抗原性则在一抗孵育后使用. 4. 游离醛基: 以醛类固定的组织可存在游离醛基(Aaldehyde group). 用1%硼氢化钠(Sodium borohydride, NaBH4), 20mM赖氨酸(Lysine)或甘氨酸(Glycine), 0.1M NH4Cl, 白蛋白(Albumin)或NGS等封闭游离醛基. ;5. Fc受体: 有些组织含有IgG的Fc受体. a. 在免疫染色直接法中, 在加一抗前用3~20%与一抗同种动物的NGS处理切片10~20分. 当用SPA法染色时用0.1% EA (卵白蛋白)代替NGS, 因为SPA可与NGS中IgG的Fc段结合. b. 在免疫染色直间接法中, 用产生二抗的动物NGS来阻止结合. 因为Fc结合位点被NGS中的IgG所占据, 不会与一抗结合. 二抗也不会与该血清中的IgG反应, 因为它们来自同种动物. 6. 天然抗体和杂质抗体: 前者指免疫动物体内已经存在的抗体, 后者是在制备抗体时因免疫原中的杂质而引起的抗体. 可用PAP等敏感方法和高效价的抗体, 或用通过高度稀释的抗血清来降低背景染色. 载体蛋白的抗体可用载体蛋白吸收抗血清. 7. 在抗体稀释液中加蛋白质: 加1%NGS(与二抗同种动物)或BSA, 可与抗血清中可能存在的杂质抗体结合, 或与一抗竞争结合于非特异位点, 减轻非特异性染色. ;8. 疏水键和离子键: IgG可通过疏水键(Hydrophobic bond)和离子键(Electrovalent bond)非特异性结合于组织蛋白或其它成分, 抗血清中的补体也可以此机制结合于组织, 再