阳离子表面活性剂胞外调控恶臭假单胞菌的生长代谢及其胞内酶催化反应的研讨.pdfVIP

404 2007年中国微生物学会学术年会 固相微萃取与气相色谱一质谱联用 鉴定分支杆菌的研究 黄利红程冬娥察冬梅 曾照睿刘为邦 (武汉钢铁集团(公司)总医院，武汉，430080) 目的用固相微萃取与气相色谱一质谱联用鉴定分支杆菌。 方法 以甲醇为衍生化试剂，在浓硫酸的催化作用下，直接在分支杆菌菌粉中把脂 肪酸转化为相应的脂肪酸甲酯，并用溶胶一凝胶BMA—OH一150复合涂层固相微萃 取探头对其进行顶空固相微萃取，用毛细管色谱一质谱联用技术对其进行分析。 结果对14种标准分支杆菌的细胞脂肪酸成分进行测定，通过对多次重复分析结 果进行比较，实现了不同分支杆菌的分类，并对I临床分离的34株分支杆菌的细胞脂肪 酸的测定结果进行了分类，并对传统的方法鉴定结果进行了比较。 讨论衍生化一固相微萃取与色谱一质谱联用技术在分支杆菌全细胞脂肪酸的测 定以及进行菌种鉴定的可能性及应用前景。 阳离子表面活性剂胞外调控恶臭假单胞菌 的生长代谢及其胞内酶催化反应的研究 苏凤宜 张健峰闫桑田邢新会 (清华大学化工系生物化工研究所，北京，100084) 背景工业生物技术在物质生产、生物能源、污染治理、环境和生产安全监测等方 面具有广泛的应用潜力，而生物催化过程的调控和强化技术是工业生物技术的重要研 究领域。恶臭假单胞菌(P．putida)是自然界中广泛存在的非致病性细菌，具有降解苯、 甲苯和二甲苯等多种芳香化合物的能力，在生物催化和环境修复方面有着极为重要的 2007年中国微生物学会学术年会 405 应用。 目的本研究利用季铵盐阳离子表面活性剂(重点研究十二烷基三甲基溴化铵， DTAB)制备P．putidamt一2的休止细胞，并考察表面活性剂对胞内酶活的影响，为实 现微生物高密度培养一整细胞催化的两步培养技术提供基础。 方法P．putidamt一2自身带有TOL质粒，通过检测芳香族化合物降解的关键 酶一儿茶酚2，3一双加氧酶(C2，30)的酶活来反映胞内的酶催化活性。为了能更好 的揭示和监控表面活性剂对整体细胞及其胞内蛋白的影响，构建P．putidamt一2工程 菌，使其具有荧光素酶(LUX)和青色荧光蛋白(CFP)两个标记蛋白，从而具有生物发光 和产萤光的功能。P．putida分别与不同浓度的DTAB、不同种类的季铵盐阳离子表面 活性剂作用，通过监测细胞浊度、pH、胞外物质的变化和脱氢酶酶活来反映表面活性剂 对细胞代谢活性的影响；通过监测LUX的发光量、CFP的荧光量和c2，30的酶活来反 映表面活性剂对胞内蛋白的影响。此外，通过SEM和AFM对菌体进行直接的观察。 综合解析阳离子表面活性剂对整细胞和胞内蛋白的作用过程和作用机理。 结果和讨论 实验结果表明，0．05 g／L以上的DTAB能有效的抑制P．putida细胞 在6h内的增殖，并且在0．2g／L以下能不同程度的保持细胞的代谢活性和生存能力， 而当DTAB浓度等于或高于0．5g／L时，细胞辅酶的再生基本上被完全抑制。SEM和 AFM的观察发现，细胞表面出现小孔状结构；随着DTAB浓度的增加，胞外辅酶NADH／ NAD的量也不断增高。这些都证明DTAB可以破坏细胞壁和细胞膜的结构，使其通透 性增加，并且通过破坏膜上的电子传递链而抑制细胞的生长代谢活性。 与不经表面活性剂处理的细胞相比，0．01—0．2 g／LDTAB可以相对提高整细胞 LUX的发光量25—85％，0．01—0．1g／LDTAB可以使C2，30的酶活提高100—150％， 而5g／L以下的DTAB并不能使CFP的荧光量产生明显下降。推测其原因，DTAB能 促进细胞膜的通透性增强，从而加快底物的进入速度，使LUX和C2，30的酶活有显著 的提高。通过超声破碎对细胞进行处理，从而排除细胞膜对传质的限制性因素，再添加 不同浓度的DTAB，结果发现LUX和C2，30的酶活都不再提高，而是随着DTAB浓度 的升高而降低，说明若直接作用于胞内蛋白，DTAB具有抑制性作用。这些都表明， DTAB对整细胞的作用