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原核表达与常用蛋白质纯化技术探讨 北京全式金生物技术有限公司 比较 pET、pMAL、pGEX 表达系统表达和纯化的优缺点。 介绍pET 表达系统表达条件的优化，纯化技巧。 离子交换纯化技巧 未知蛋白如何选择纯化方法，纯化方法如何组合？ 三大表达系统比较 pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) T7/lac 启动子，IPTG 诱导表达，6 XHis, 标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响。纯化及其方便。 pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) Tac 强启动子， MBP 融合，可溶性表达，纯化难以控制，Maltose 一步洗脱，得到的蛋白纯度较低,需要去掉MBP 。 pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) Tac 强启动子， GST 融合，可溶性表达，纯化难以控制，GST 一步洗脱，得到的蛋白纯度较低。需要去掉GST. 三大系统纯化蛋白比较 GST 和 MBP 一个浓度一步洗脱，蛋白纯度低。 MBP 纯化 MBP 融合蛋白 MBP GST 纯化 GST GST 融合蛋白 His 咪唑浓度梯度洗脱，纯化效果 理想。 杂蛋白 咪唑梯度/mM 20 40 80 120 160 目的蛋白 His 纯化 pET载体诱导表达——经典的表达系统 表达条件的优化：蛋白不表达，或表达量低，如何解决？ 温度对表达的影响 培养基对表达的影响（e.g. Glucose 对表达的影响） 菌株的选择 不同克隆表达水平的差异 溶氧量与培养体积 不同菌株对表达量的影响 不同菌株对蛋白表达的影响 1 2 4 3 pET28a Lane 1：BL21(DE3) Lane 2：BL21(DE3)pLysS Lane 3：Rosetta(DE3) Lane 4：BR21CodonPlusRIL 目的蛋白 1：BL21(DE3)； 2：BL21(DE3)pLysS； 3：Rosetta(DE3) 目的蛋白 M 1C 1I 2C 2I 3C 3I 不同菌株对蛋白表达的影响 pET28a 载体表达真核基因菌株的优化 Another Gene 含有稀有密码子：Rossetta (DE3) 蛋白表达的菌株选择 菌株 启动子 特性 BL21 tac (pGEX、pMal) 适用于非T7启动子的表达系统，适用于毒性蛋白的表达 BL21(DE3) T7 (pET) 适用于T7、T7/lac的表达系统，适用于非毒性蛋白的表达 BL21(DE3)pLysS T7 (pET) 含有质粒pLysS，具氯霉素抗性，该质粒含有表达T7溶菌酶的基因，可降低目的基因的背景表达水平。适用于毒性和非毒性蛋白的表达 Rosetta(DE3) T7 (pET) 补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平 BL21CodonPlusRIL T7 (pET) 适用于富含AT的真核生物基因的表达 BL21CodonPlusRP T7 (pET) 适用于富含GC的真核生物基因的表达 Origami T7 (pET) 具有thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。 某些表达载体的表达效率在放大培养时无法提高 主要是溶氧量的问题, 可以通过在摇瓶中加入不同量的培养基的方式来确定最佳体积 一般不要超过容器容积的1/10，最多不超过1/5 包涵体 成因：蛋白合成速度过快，无法正确折叠 解决办法 选择不同的菌株与载体的组合 降低蛋白表达的速度影响蛋白积累的速率：温度，转速，IPTG浓度，诱导OD值…… Origami 宿主菌thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变，帮助形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。 1 2 3 1 2 3 1 2 3 37℃ 25℃ 18℃ 不同温度下的表达对包涵体蛋白形成的比较 Lane 1:全菌蛋白 Lane 2:沉淀蛋白（包涵体） Lane 3:上清蛋白（可溶） His 蛋白纯化 基本原理 影响纯化的因素咪唑浓度与pH值——咪唑对蛋白纯化的影响离子强度去垢剂、还原剂与螯合剂 常见问题 带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上 Ni-chelating分离纯化的效果不好 ; 目的蛋白 目的蛋白 咪唑梯度/mM 1