第十一章 固相膜免疫分析技术PPT.pptVIP

斑点金免疫层析试验(DICA) 是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的固相膜免疫技术，与斑点金免疫渗滤试验的过滤性能不同，DICA是滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判断实验结果。 层析试纸条结构示意图 双抗体夹心法（大分子抗原） 　　A、B都为吸水材料，C为金标抗体干片，T区包被特异性抗体，R区包被抗小鼠IgG（抗金标抗体） 检测操作步骤 3.. 双抗体夹心法结果判断 竞争法（小分子抗原） A、B为吸水纸 G 金标抗原 T标准抗原　C金标抗抗体 竞争法结果判断 阴性 阳性 无效 间接法（测抗体） 双抗原夹心法（测抗体） A、B为吸水纸 G 金标抗原 T标准抗原　C针对抗原的抗体 （三）临床应用及评价 优点：本法操作简单、快捷以及操作人员不需技术培训，无需仪器设备试剂稳定，便于保存，已成为“床旁检验”的主要方法之一。 缺点：只能定性不能定量，且灵敏度不如酶标法和酶发光免疫测定。 因此金免疫技术在临床上常用于快速筛查试验。 第二节 其他膜载体免疫分析技术 一、斑点酶免疫吸附试验（Dot-ELISA） 该试验与常规的ELISA相同，不同之处在于斑点-ELISA所用载体为对蛋白质具有极强吸附力（100%）的硝酸纤维素膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使膜染色。 Dot-ELISA 原理示意图 Dot-ELISA 技术要点和方法学评价 技术要点： 抗原包被膜、抗原抗体反应、显色反应 方法学评价： 灵敏度高、试剂用量少、 操作简单、结果易保存。 二、免疫印迹试验 　　免疫印迹试验（IBT）亦称酶联免疫电转移印迹法，是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的技术，具有分析容量大、灵敏度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。 IBT 原理示意图 临 床 免 疫 学 检 验 临 床 免 疫 学 检 验 临 床 免 疫 学 检 验 临 床 免 疫 学 检 验 临 床 免 疫 学 检 验 临 床 免 疫 学 检 验 固相膜免疫分析技术 第十一章 【学习内容】 第一节 胶体金免疫技术 胶体金与免疫金的制备 胶体金免疫技术的方法学种类与原理 第二节 其他膜载体免疫分析技术 斑点酶免疫吸附试验 免疫印迹试验 【学习目的】 【问题导读】 第一节 胶体金免疫技术 胶体金免疫技术(colloidal goldimmunoassay)：　　　　　　是一种以胶体金作为标记物，用于抗原抗体反应来检测抗原或抗体的免疫标记技术。 　 现该技术广泛应用于急诊医学、输血医学、现场诊断及个体自我体检等方面，且简便、快速、安全，其主要模式有斑点金免疫渗滤和层析试验。 一、 胶体金与免疫金的制备 胶体金(colloidal gold)也称金溶液，是由金盐被还原成原子金（Au）后形成的金颗粒悬液。 氯金酸（HAuCl4） 白磷、枸橼酸钠 静电作用 金颗粒 胶体金 胶体金颗粒 基础金核 双离子层（内负外正）正） （还原剂） 1.胶体特性 胶体金颗粒大小多在1~100nm，微小金颗粒稳定、均匀、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。 2.稳定性 不受重力影响，与本身带电荷有关，同时对电解质较敏感，电解质可破坏胶体金外周水化层，而使其聚体沉淀下来。 （一）胶体金的特性 3.呈色性和吸光性 向一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂使金离子还原成为金原子，形成金颗粒悬液。常用的还原剂有：枸橼酸钠、白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、鞣酸等。 （二）胶体金的制备 以枸橼酸钠为例说明制备方法： 1、制备一定浓度的HAuCl4水溶液，加热至沸。 2、搅动下准确加入一定量的枸橼酸三钠水溶液。 3、继续加热煮沸一定时间。观察溶液变化：淡黄色 灰色 黑色 红色。 4、冷却至室温后加蒸馏水恢复至原体积。 胶体金的鉴定 主要鉴定指标有：颗粒大小、粒径的均一呈度、有无凝集颗粒。 良好的胶体金应该是清亮透明的，如混浊或液体表面有漂浮物，提示制备的胶体金有较多的凝集颗粒。 胶体金优劣表象 优质 劣质 胶体金的保存： 　　 胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，避光无尘环境，温度应在40C，避免低温贮藏。 制备胶体金的注意事项： (1)氯金酸