大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体的构建及优化研究.pdf

摘 要 穿梭载体研究克隆基因在细胞中的表达，以及探索基因功能及表达调控机理方面 具有重要意义。目前，国内外在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳类动物 细胞上都建立了不同的表达系统，其中人们对大肠杆菌进行了长期研究，对其特性和 遗传背景了解的非常清楚，而枯草芽抱杆菌具有非治病性，因此构建既在大肠杆菌， 又在枯草杆菌中表达的穿梭载体用于克隆基因的表达有很大价值.本文以P59为启动 子，构建了可在大肠杆菌和枯草杆菌中表达的表达载体GJOI，其带有氯霉素抗性筛选 标记基因，并以0-半乳糖昔酶基因((bga)作为报告基因检测所构建载体的表达特性。 为了得到高效的表达载体，对所构建的载体进行了优化，为下一步建立枯草杆菌高效 表达载体系统奠定了基础。 通过PCR克隆了大肠杆菌的复制子rep，然后将rep连接到质粒pBluSKM上得到 E3,然后酶切rep和部分多克隆位点与PCR扩增的pGDVI的骨架连接，构建了大肠 杆菌和芽抱杆菌之间的穿梭克隆载体pGDVM。此载体带有大肠杆菌和芽抱杆菌的复 制子、氯霉素抗性基因和多克隆位点，便于在大肠杆菌和芽抱杆菌中进行克隆操作。 以P59为启动子，以构建的pGDVM为骨架，从pAX01上PCR扩增核糖体结合 位点RBS1和终止子序列克隆到pGDVM上，即构建成大肠杆菌和芽抱杆菌之间的穿 梭载体GJOI。以P一半乳糖昔酶基因((bga)作为报告基因检测表达载体GJO1的表达 活性，在大肠杆菌和枯草杆菌中13一半乳糖昔酶 (Bga)活性最高分别达到75.3和83.2 个密勒单位，表明所构建的载体具有较强的表达活性。以核糖体结合位点RBS2,RBS3, RBS4和RBS5代替GJO1-bga中的RBS1，对构建的载体进行了优化。得到GJ02-bga 中Bga在大肠杆菌的酶活性达到253.8个密勒单位(miller),GJO5-bga中Bga在芽抱杆 菌中的酶活性达到 135.4个密勒单位，为构建大肠杆菌和芽抱杆菌之间的穿梭表达系 统奠定了基础. 以枯草杆菌1094为材料，克隆了枯草芽抱杆菌生物素操纵元基因的bioW和bioB 基因，构建了两基因的表达载体GJOI-bioW和GJOI-bioB，对两基因进行了表达，通 过微生物法和高压液相色谱法测定了生物素的表达量。结果表明在摇瓶培养36h和48h 时，构建菌株的生物素产量明显低于宿主菌的生物素产量。用测量OD值法也得到同 样的结果。由此表明bioW和bioB基因的高表达对宿主菌具有生长抑制作用，为工业 发酵提供参考。 关键词::大肠杆菌;枯草杆菌;表达载体:生物素 Abstract Itisimportantthatusingshuttlevectorinstudyinggeneexpression,genefunctionand mechanism expressingmodulation。Presently,differentexpressionsystemhasbeen constructedinE.coli,B.subtilis,Yeast,insectcellandmammaliancell.Thecharacteristic andgeneticbackgroundofE.colihasbeenstudiedclaritythroughlongstudy,andB.subtilis isnoharmful.SoitisworthconstructingShuttleVectorofE.coliandB.subtilistoexpress gene.UsedpromoterP59aspromotertoconstructashuttlevectorGJ01withgene chloramphenicolasriddlinggene,andbgawasusedasreportgenetodetectitsexpress abiliyt.Inordertogetagoodvector,weoptimizethevectorthroughreplaceitsRBS. ReplicatorofE.coliwereclonedthroughPCR,andthenconnectwith pBluSKMto getplasmidE3.ReplicatorandMCSrfom马wereclonedtoPCRamplificationofpGDV1 to酗 pGDVM,whi