石蜡包埋组织免疫荧光染色的技术改进.docVIP

精品论文 参考文献 石蜡包埋组织免疫荧光染色的技术改进 陈琼霞1 陈莹1 黄萱2 刘丽江2（通讯作者） （1江大病理诊断所技术部 湖北武汉 430056） （2江大病理诊断所组织病理诊断部 湖北武汉 430056） 【摘要】目的 探讨抗原修复方法在石蜡包埋组织免疫荧光染色中的应用。方法 石蜡切片经0.2%Triton X-100和0.5%Triton X-100梯度去垢剂（细胞表面活化剂）处理后，进行免疫荧光染色。结果 免疫荧光染色结果定位明确，无扩散效应和非特异性着色。其染色强度接近石蜡包埋切片的免疫组化染色效果。结论 低浓度梯度去垢剂Triton X-100进行抗原修复，技术方法简单可行。 【关键词】免疫荧光 染色抗原 修复 【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）04-0368-02 石蜡包埋组织的免疫荧光染色技术，在基础研究以及临床病理诊断中仍发挥着重要的作用。尤其是在多重标记物的定位、膜抗原的鉴定、抗体的类型（荧光标记抗体）、微量蛋白质的定位以及肾穿刺组织活检的病理诊断中具有非常重要的地位。但是，组织经过福尔马林固定后，在固定的过程中Ca2+和其他二价离子与蛋白质所形成的紧密复合物，封闭了抗原，导致在石蜡切片上进行免疫荧光染色时，抗原抗体的结合受阻，直接影响染色结果的特异性和敏感性[1]。在临床的实际工作中，常常又会遇到只有石蜡包埋的材料，而又必须进行免疫标记的情况。如：肾穿刺活检组织冰冻切片中没有肾小球，不得不在石蜡包埋组织中解决诊断的问题等等[2-3]。因此，在技术上解决石蜡包埋组织的免疫荧光染色问题，具有非常重要的临床应用价值。我们采用去垢剂修复抗原法对石蜡切片进行抗原修复后，再行免疫荧光染色，取得了比较好的效果。 1 材料与方法 1.1石蜡切片的制备：新鲜组织经10%中性福尔马林固定24小时，常规脱水、浸蜡后包埋。按照常规制备石蜡切片。切片裱在预先制备好的涂有防脱片胶（如多聚赖氨酸）的切片上待用。 1.2抗原修复：取出石蜡切片二甲苯脱蜡15分钟times;2，无水乙醇3分钟times;2，95%乙醇3分钟times;2，85%乙醇3分钟times;2，蒸馏水3分钟，PBS水化缓冲10分钟。加入0.2％Triton X-100室温下4分钟，弃去液体，加入0.5％Triton X-100室温下10分钟；弃去液体后PBS振洗3分钟times;3。 1.3免疫荧光染色步骤：免疫荧光封闭液室温下封闭内源性的抗原，30分钟后直接弃去，滴加特异性的一抗，4℃16小时; PBS振洗5分钟times;4，滴加荧光标记的二抗（如Cy3标记的二抗），室温避光孵育60分钟；PBS避光振洗5分钟times;4，滴加细胞核复染剂（如Hoechst33258染色液）复染胞核5分钟；PBS避光振洗3分钟times;2，加入抗荧光淬灭封片剂封片，镜下观察。 2 结果 石蜡切片经梯度去垢剂（0.2%Triton X-100rarr;0.5%Triton X-100）修复抗原后，免疫荧光染色的结果定位明确，无扩散效应和非特异性着色。染色强度可以达到或接近石蜡包埋切片的免疫组化染色的效果（图-1）。 图1 石蜡切片的免疫荧光染色，显示细胞膜和细胞质阳性，结果清晰，背景无非特异性着色。 3 讨论 石蜡包埋组织的免疫荧光染色技术面临的主要技术问题是抗原的修复。当组织经过福尔马林固定后，Ca2+和其他二价离子与蛋白质形成的复合物，封闭了抗原的决定簇，或导致抗原出现折叠等空间构象的改变，这样在石蜡切片上进行免疫荧光染色时，抗体很难与相应的抗原结合，影响了染色结果的特异性和敏感性。所以，需要解决的关键技术是抗原修复。 石蜡切片免疫荧光染色常用的抗原修复方法有：微波修复、高压加热变性修复和酶消化修复。微波修复通过作用于醛乙氨基的交联，使之断裂而暴露抗原决定簇。但是，对于抗原含量比较少、膜抗原等，往往由于醛乙氨基交联断裂，而导致待测抗原的丢失，使敏感性降低。高压加热则是通过高温下的EDTA与Ca2+形成螯合双价金属离子盐，即将Ca2+等二价的离子从与蛋白质结合的部位上解离下来，达到消除甲醛固定时所产生的抗原决定簇被封闭的不利因素。此外，在120℃的高温下，维持蛋白质三级结构的氨基酸侧链基团的次级链断裂，也为抗体的结合提供了更多的机会。但是，高压高温下不仅可导致组织的破坏和容易脱片，还面临着严重的假阳性问题。酶消化修复是通过细