发菜多糖的提取与纯化研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵．v-S[学术讨论会论文集 发菜多糖的提取与纯化 贾士儒1， 林永贤， 于海峰 (天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300222) 摘要：采用超滤技术处理发菜细胞培养液，乙醇沉淀法提取水溶性多糖。依次采用DEAE 谱分析鉴定该多糖。凝胶层析表明为一种多糖，紫外光谱分析未见蛋白质(280nm)与核酸 (260nm)的特征吸收蜂。结果表明，所提取的发菜多糖NFP2为单一组分的多糖。 关键词：发菜；多糖；分离，纯化 引 言 发菜(发状念珠藻，Nostoc 菌，在我国主要分布于宁夏、甘肃、青海、新疆、内蒙古、河北等省区。发菜多糖是其在自 然生长过程中分泌到细胞外的一种胶质物质，对发菜适应恶劣自然环境有重要作用。研 究发现发菜多糖对流感病毒、人巨细胞病毒、单疱疹病毒等多种具有封套的病毒有很强 的抗病毒活性Ⅲ。发菜自然生长极为缓慢，对发菜的不合理采收导致发菜资源濒临枯 竭，发菜生长地的生态环境遭到严重破坏。因此，国务院于2000年6月15日禁止发菜的 采收、加工和销售。发菜细胞液体悬浮培养技术可以在不消耗野生发菜资源的前提下得 到大量发菜细胞和培养液，可以直接从细胞培养液中提取发菜多糖。本文针对发菜细胞 培养液多糖含量低，不易提取的情况，对发菜细胞培养液中发菜多糖的提取和纯化进行 了研究。 1 材料与方法 1．1材料 发菜(Nostocflagelliform)细胞培养液由天津科技大学生化工程研究室提供。 1．2仪器 1-4／LD冷冻干燥机， 中空纤维膜超滤装置，752型紫外光栅分光光度计，ALPHA UV2401紫外可见光谱仪 1．3 方法 1．3．1发菜细胞培养液的超滤浓缩嗍发菜细胞培养液经离心(3000r／min，5rain)后， 上清液利用中空纤维膜超滤装置超滤浓缩。 基金项目：国家自然科学基金和天津市科技发展计划重点基金(043801611) 通讯作者：贾士儒(E--mailjiashiru(勇tust．edu．cnTel；022- 贾士儒等：发菜多糖的提取与纯化 1．3．2多糖的提取利用乙醇沉淀法，向超滤浓缩液中加入乙醇，使其中乙醇含量分别 为50％，60％，70％，80％，90％，收集沉淀，冷冻干燥。 1．3．3多糖含量的测定苯酚一硫酸法[3] NaCI溶液梯度洗脱。苯酚一硫酸法检测多糖分布情况，收集多糖反应为阳性的洗脱液， ’ 透析，浓缩。 Sephadex adex 析，浓缩。 G一100凝胶层析法，条件同上。 1．3．5纯度鉴定Sephadex 外分光光度计扫描，得到多糖的紫外吸收光谱。 2 结果与讨论 2．1发菜培养液的超滤浓缩 发菜培养液的多糖含量较低(质量分数为0．01％左右)，用乙醇沉淀法不能从中直接 提取多糖。采用超滤浓缩不但可以提高多糖浓度，还能除去培养液中的小分子物质，节 省提取成本和时间，适合处理大量培养液。 采用中空纤维膜超滤装置，对发菜培养液进行了超滤浓缩。在压力为0．02MPa，温 度25℃下，研究了超滤时间对膜通量的影响，如图1所示。从图可以看出，初始膜通量下 降较快，主要是膜表面迅速吸附有机胶体等物质所致。在超滤后期，膜通量急剧下降，仅 为刚开始的70％。这是因为超滤后期料液的浓度和粘度迅速增大，多糖在膜表面形成了 不流动的凝胶层，使膜的阻力增加，加速浓差极化，从而表现为膜通量的急剧下降[4’5’6】。 如果持续运行将会引起膜的严重污染。因此，从节约操作时间和延长膜的使用寿命考 虑，操作过程中当膜通量急剧下降时，应结束操作，此时多糖浓度在4．5goLq左右。 2．2乙醇浓度对多糖得率的影响 取浓缩培养液20ml，加入乙醇，使其中乙醇含量分别为50％、60％、70％、80％、 90％，得多糖沉淀，冷冻干燥后所得多糖质量如图2所示。 随着乙醇含量的增加，所得多糖质量的也在增加。这是因为乙醇含量增加直接会导 致水溶液的介电常数的下降，多糖在水中的溶解度降低而析出。乙醇含量从60％到