肿瘤分子检测实验内容1检测技术分类art-pcr检测基因碱基突变i.pdf

肿瘤分子检测实验内容 1. 检测技术分类 a) RT-PCR 检测基因碱基突变 i. 提取病灶总RNA ii. 总RNA 反转录cDNA iii. RT-PCR 目的基因片段（具体内容由朱启超老师下订单） iv. 目的片段回收，连接T 载体，转化大肠杆菌，每片段挑取10 个单克隆，提取 质粒DNA，进行DNA 测序 v. 序列打包发邮件给郭栋梁老师与朱启超老师 b) QPCR 检测基因表达变化 i. 提取病灶总RNA，提取对照（静脉血或正常组织）RNA; ii. 总RNA 反转录cDNA; iii. 进行相对定量 qPCR，检测病灶与正常组织间，目的基因的表达差异（具体原 理与实验操作，详见附件nature protocol 文献） c) QPCR 检测基因在基因组中的拷贝数变化 i. 提取病灶总DNA，提取对照（静脉血或正常组织）DNA; ii. 进行相对定量 qPCR，检测病灶与正常组织间，目的基因的拷贝数差异原理同 上； d) RT-PCR 检测基因融合 （主要检测融合基因的示意图详见图1） i. 提取病灶总RNA ii. 总RNA 反转录cDNA iii. 根据发生融合的两个基因片段分别设计上下游引物，进行 RT-PCR，如果基因 发生融合，则会有大小正确的目的片段产生，如果没有发生基因融合，则不会 有大小正确的目的条带。如果得到大小正确的目的条带，则需要进行条带回收， 直接用PCR 产物进行测序。 图1 融合基因示意图 e) 甲基化特异PCR （MS-PCR）检测基因启动子甲基化修饰情况 i. 具体内容参见文献，目前只有MGMT 基因进行MS-PCR 的检测； 2. 各种肿瘤检测具体内容 a) 非小细胞肺癌 i. EML4-ALK 基因融合 ii. KIF5B-ALK 基因融合 iii. TFG-ALK 基因融合 iv. SLC34A2-ROS1 基因融合 v. CD74-ROS1 基因融合 vi. EGFR 基因序列突变 vii. KRAS 基因序列突变 viii. BRAF 基因序列突变 ix. PIK3CA 基因序列突变 x. PTEN 基因序列突变 xi. MET 基因在基因组中的拷贝数变化 b) 胶质瘤 i. EGFR 基因序列突变 ii. KRAS 基因序列突变 iii. EGFR 基因序列突变 iv. c-kit 基因序列突变 v. EGFR 基因在基因组中的拷贝数变化 vi. EGFR 基因表达变化 vii. KDR (VEGFR2) 基因表达变化 viii. CD95 (FAS) 基因表达变化 ix. MGMT 检测基因启动子甲基化修饰情况 c) 乳腺癌 i. ER 基因表达变化 ii. PR 基因表达变化 iii. HER2 基因表达变化 iv. PIK3CA 基因序列突变 v. PTEN 基因序列突变 d) 肾癌 i. KDR 基因表达变化与基因在基因组中的拷贝数变化 ii. PDFGR 基因表达变化与基因在基因组中的拷贝数变化 iii. RAF1 基因表达变化与基因在基因组中的拷贝数变化 iv. c-kit 基因表达变化与基因在基因组中的拷贝数变化FGF19 e) 肝癌 i. KDR 基因表达变化与基因在基因组中的拷贝数变化 ii. PDFGR 基因表达变化与基因在基因组中的拷贝