第3章 载体.pptVIP

转录终止子：基因编码区下游一段使转录终止的核苷酸序列。 SD序列：原核生物结构基因起始密码子上游与核糖体30S亚基识别和 结合的位点，称为核糖体结合序列即SD序列。 （2）表达方式包括组成型表达、诱导型表达、融合型表达、分泌型表达。 组成型表达：持续不断地表达目的蛋白。 诱导型表达：在诱导物存在的情况下表达目的蛋白。 融合型表达：表达载体的多克隆位点上有一个融合表达表达标签， 表达的蛋白为融合蛋白。 分泌型表达：在起始密码和目的基因之间加入一个信号肽，可以引导目的 蛋白穿越细胞膜，分泌到细胞外。。 （二） 酵母表达载体 （三） Ti质粒表达载体 1.天然Ti质粒的结构及其致瘤功能 Ti （tumor inducing plasmid）质粒是根癌农杆菌中可引发植物产生冠瘿瘤的致瘤； 大小为200-250kb； Ti 质粒可分为4个功能区：T-DNA、Vir、Con、Ori T-DNA区：Ti质粒中能够转移到植物细胞内的区域，称为T-DNA 即 transfer DNA 2. Ti质粒表达载体 一元载体：指含目的基因的中间表达载体和改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。 双元载体：指由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。 双元载体的特点： a.大肠杆菌和农杆菌穿梭载体； b.可用基因枪或农杆菌介导进行遗传转化； c.转化效率高于一元转化载体。 第三章 载体 载体：能够携带外源基因（或DNA片段）进入细胞复制、 整合或表达的工具称为载体（Vector） 克隆载体 表达载体 第一节 克隆载体 克隆载体：用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体 克隆载体必备条件： ① 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞； ② 能在宿主细胞中自主复制，或整合到宿主基因组中随其一起复 制， 实现外源基因的增殖； ③ 具有由单一限制性内切酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因 插入； ④ 具有合适的选择标记，用于含有重组载体的宿主细胞筛选。 用于基因克隆的载体的类型： 质粒载体（plasmid vector） 噬菌体载体（phage vector） 考斯质粒（cosmid vector） 人造染色体载体（artificial chromosome） 一、质粒载体 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子； 质粒常见于原核细菌和真菌中； 绝大多数的质粒是DNA型的； 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA； 质粒的分子范围：1-200kb。 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得 寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物； 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱。 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。 (一) 质粒的基本性状 1. 复制 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统自主复制； 根据寄主每个细胞内分子数（拷贝数）多少，质粒可分为两大复制类型： 严谨型：1-9拷贝 松弛型：10个以上 （三）常用的质粒载体 1. pBR322质粒载体 2. pUC18和pUC19质粒载体 3. TA载体 二、噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质 外壳蛋白 λ噬菌体 线性，全长48502bp λDNA 5’端含12bp的黏性末端 （一） λ 噬菌体载体 2 λ 噬菌体的构建 a.λ 噬菌体能够包装原λDNA长度的75%－105%的DNA片段 （36.4~51kb） b.有20kb的区域对λ噬菌体生长非必需。 构建λ 噬菌体的依据： λ 噬菌体载体的改造： ①切除非必需区段，保证构建的λ噬菌体载不小于36.4kb， 插入或替换外源基因后不大于51kb； ②在λDNA分子的合适区域插入可供筛选的标记基因： cI基因失活、Spi筛选、Lac蓝白斑筛选 ③建立重组 λDNA分子的体外包装系统。 体外合成噬菌体外壳蛋白D和E。 5.5kb 2.6kb 4.9kb 该λ 噬菌体载体的最大装载容量为: 4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb 3 代表性λ 噬菌体 (