不同激活方法对猪卵母细胞体外发育的影响研究.pdf

不同激活方法对猪卵母细胞体外发育的影响 黄雅琼 王晓丽 陈自洪崔奎青杨素芳 陆凤花谭世俭石德顺。 (广西大学动物繁殖研究所，南宁530005) 摘要本研究系统探讨了不同孤雌激活方法对猪卵母细胞体外激活后发育效果的影响。对使用不同激活 方法以厦不同抑制荆对猪卵母细胞体外发育的影响进行了分析。比较了酒精(EⅡ啪0l，EH)、离子酶素(Iono- mycin，ION：5删L)、氯化锶(st∞ti哪枷。耐e 母细胞鼓果好．I∞+6一DMAP纽的囊胚率为37．50％。(4)卵母细胞的卵丘细胞层数不同时卵母细胞成熟激活 有显著的影响，卵丘细胞层敷多于6层的卵母细胞的囊胚率为”．68％，其孤雌激活的发育能力极显著高于其他 成熟率、卵裂率和囊胚率均高于TcM一199纽。 关键词猪激活孤雌发育体外培养 猪在畜牧业生产中的地位举足轻重，与人们的生活联系紧密。体细胞核移植的成功极大促进了猪 细胞核移植等相关技术的研究。猪卵母细胞成熟后的激活研究一直是一个热点和关键内容。通过有效 地选用体外成熟的猪卵母细胞”’23，采取不同的激活方法研究猪卵母细胞孤雌胚胎的发育潜力，有助 于充分探明影响猪卵母细胞体外激活机制以及早期胚胎体外培养的影响因素，从而构建完善的成熟激 活培养体系，促使卵母细胞体外优质发育，以期能够达到充分支持体外胚胎完成发育的全部过程。猪 在为人类提供可用异体移植器官和转基因治疗等方面有巨大的发展潜力和现实意义，探讨猪卵母细胞 的激活方法可为相关领域奠定研究基础和技术平台。 l材料和方法 1．1卵母细胞的采集 从屠宰场采集青年母猪卵巢后，放入含有抗生素(青、链霉素)的生理盐水中，保温在30一 35℃，尽快运送回实验室。用12号针头的10rⅡ1注射器抽取猪卵巢表面直径3～8Ⅱlnl卵泡内的卵泡液 及卵母细胞，收集含有卵母细胞的卵泡液于锥形量筒内，放置于cO：培养箱中10I|Iin后取出，抽取 上层卵泡液弃去。下层沉淀用洗卵液稀释并放人小玻璃皿中。在体视显微镜下挑选出具有完整卵丘细 胞层和部分致密卵丘细胞的卵母细胞，并清洗干净。整个采卵和捡卵过程中使用38℃加热板进行 ·基金项目：国家。撕3”计划贷助项目(2005^^206130)，转基因克隆水牛平台技术研究。 e血cⅡ。 通讯作者：石德顺，研究员，博士生导师；E一叫Iil：抓Ⅻ@胛L ·171· 籀营养与饲嚣；研究进展 保温。… l-2卵母细胞处理方法 1_2．1卵母细胞的成熟 stimulating 清洗干净的150枚卵母细胞放入1IIll含有激素O．1ng／Ⅱll胯H(FoⅡicleHomone：FsH， Follice 促卵泡素)的成熟培养液(无血清的TCM一199基础液+10％PFF(P0rcinenllid，PFF，猪 Growtll 卵泡液)+10n∥ⅡdEGF(Ep汕eliumF扯tor，EGF，表皮生长因子)+0．1m吕／IIllcysteine(半 胱氨酸)的玻璃平皿中，放置在38．5℃，5％c0：和最大饱和湿度的培养箱中22—24h后，再放入不 成熟率。 1．2．2卵母细胞的激活 卵母细胞经体外成熟后，先用100山的移液枪反复吹打或者放人透明质酸酶5rIlin除去卵丘细胞， 使用不同的激活方案，物理激活、化学激活及联合激活等处理成熟后的猪卵母细胞并探讨其对激活效 果的影响。在EH作为激活剂的激活方案中，使用在基础液中添加不同的5％、7％、9％、11％、 行孤雌激活处理，化学激活方法是将成熟后去除颗粒细胞的猪卵母细胞分别放入5岬oL／LION中激 活5min和9％酒精中10嘶n，再分别用胚胎培养液清洗两次，然后分别放人2mmoL／L6一DMAP中的 培养液中3～4h；电激活方法将成熟后去除颗粒细胞的猪卵母细胞放人清洗干净的含有融合液电融合 脉冲次数)作用下进行电激活处理，用胚胎培养液清洗两次，再结合6一DMAP处理3—4h。研究猪 不同卵丘卵母细胞