连接转化鉴定亚克隆.pptVIP

4. Transformation: Ligation mixture is introduced into Bacteria JM109 5. Isolate recombinant pET28a plasmid，酶切,电泳 亚克隆已经完成! 测 序 How to construct recombinant plamid？ RE 酶切 RE 酶切 连接 总结： 基 因 克 隆 的 基 本 过 程 ① ② ③ ④ 重点： 如何用PCR、RT-PCR 法获得目的基因， 及随后的DNA recombinant technology： TA克隆， 转化， 鉴定： 质粒的提取及酶切电泳， DNA Sequencing， 亚克隆 总 结：基因克隆的过程 难点：蓝白筛选 Insertion inactivation Antibiotic screening Plate Screening 蓝白筛选 Blue-white screening 重组DNA的应用 DNA重组 技术 克隆基因表达 克隆基因测序 核酸探针标记 转基因 构建 打靶载体构建 基因治疗载体构建 构建文库 基因敲除 Or 基因敲入 cDNA文库构建 基因组文库构建 核酸分子杂交 转基因 基因治疗 原核表达 真核表达 Southern Blot Northern Blot * 第一节 基因克隆的概念和基本步骤 第四章 基因克隆 第二节 工具酶 第三节 载体 第四节、目的基因的制备 第五节、获得重组DNA：目的基因与载体的体外连接 第七节、 重组子的筛选和鉴定 第八节、 目 的 基 因 的 次 级 克 隆 第六节、转化:将重组DNA分子导入宿主细胞 过程 工具 第五节、获得重组DNA ----目的基因和载体的体外连接 Target DNA fragment RE digestion Plasmid RE digestion Ligation Recombinant plasmid Target DNA fragment Transformation E.Coli without vector die E.Coli with vector grow Culture in the medium containing antibiotic Target gene EcoRI BamHI EcoRI BamHI Vector Vector digestion digestion Ligation Vector EcoRI BamHI 1、双酶消化的粘性末端连接: 定向连接。 连接效率高。 Ligate sticky ends produced by two different restriction enzymes ----G AATTC--------------AAGCTT---- ----CTTAA G-------------TTCGA A---- CTTAA G-------------TTCGA A G AATTC--------------A AGCTT CTTAA G---------------TTCGA A Vector Target gene EcoRI: GAATTC HindIII:AAGCTT 例子： 定向连接。 连接效率高。 2、单酶消化的粘性末端连接 连接效率高; 载体需去磷酸; 双向连入载体 Ligate Sticky ends produced by one restriction enzyme Vector EcoRI EcoRI EcoRI Vector EcoRI digestion Ligation Recombinant vector Recombinant vector Recombinant vector EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI Alkaline phosphatase E.coli 修复 Gene goes into vector in either direction EcoRI digestion Vector EcoRV EcoRV digestion Vector Taq DNA polymerase dTTP T-Vector 5 5 T T 5 5 A A PCR product Recombinant vector A A T T PCR product Ligation 连接效率高 双向连入载体 自身环化率 PCR 产物与T载体之间的连接. 3、T-A粘性末端连接 TA Cloni