常用标记技术(上课用)20100929.ppt

常 用 标 记 技 术;标记技术的种类—按标记物分;标记技术的种类—按标记方法分;一、免疫标记技术; 免疫标记技术;常用的免疫标记物质;酶免疫技术的基本特点：;常用酶及其底物;;酶联免疫吸附试验（ELISA）：是指将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，通过洗涤将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。 分类：双抗体夹心法、间接法、BAS-ELISA。;分类;ELISA(双抗体夹心法)检测HBsAg原理示意;ELISA-间接法—测未知抗体;竞争法—抗原、抗体;BAS-ELISA:以生物素-亲和素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一种新的生物放大系统，进一步提高检测的敏感度。 一个亲和素分子可以结合四个生物素分子，结合非常稳定。亲和素和生物素可以与酶、抗体、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲和素。因此大大提高检测的敏感度。;酶标仪;酶标仪;（2）免疫荧光技术;1.直接荧光法 优点：简单、特异 缺点：检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，敏感性低于间接法。;2.间接法 优点：敏感性高、只需制备一种荧光素标记抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原。;3.放射免疫技术(radiommunoassay,RIA)是指将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。;假设受检标本中不含抗原时的反应条件为： 4（Ag*）＋2（Ab）→2（Ag*Ab）＋2（Ag*） 在标本中存在抗原时，举例如下： 4（Ag*）＋4（Ag）＋（2Ab）→ 1（Ag*Ab）＋3（Ag*）＋1（AgAb）＋3（Ag）;胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。;斑点金免疫渗滤试验：是指将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上，依次在膜上滴加标本、免疫金及洗涤液等试剂并与硝纤膜上的相应抗体或抗原发生反应，过量试剂很快渗入吸水材料中。抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。 金免疫层析试验：;技术要点;;斑点金免疫渗滤试验： 金免疫层析试验：是指用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。将各种反应试剂分点固定在试纸条上，检测标本加在试纸条的一端，通过毛细血管作用，使样品溶液在层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成的复合物被富集或固定在层析条上的特定区域（检测线），通过标记免疫技术显色。;1.双抗体夹心法;2.竞争法 ;3．间接法;;测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶，然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处时，在F处加缓冲液，合上测试卡，A处的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非特异性IgG及无关物向E处反向层析，随后而来的金标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色线条。无棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗体。;（5）化学发光技术;基本原理：利用已知的核苷酸序列DNA片段作为探针，按照碱基配对的互补原则去识别组织切片或细胞涂片中的待测DNA或RNA，并与之特异结合，即DNA经变性处理（如热、酸、碱），碱基间的氢键发生断裂，使双链DNA解离成单链。当终止变性处理，逐渐恢复温度及pH值时，被分开的单链自动地复性形成原来的双链结构。由于碱基是严格配对的，因此一种探针DNA只能与待检标本互补DNA结合。因此将标记有同位素、荧光素、生物素或地高辛的探针DNA固定在标本上，用放射自显影技术或免疫组织化学技术可显示出探针DNA相结合的待测DNA或RNA.;二、原位分子杂交技术;二、原位分子杂交技术;二、原位分子杂交技术;（二）探针种类（1）基因组DNA探针  为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。（2）cDNA探针 以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。 （3）RNA探针 以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。（4）寡核苷酸探针;2.核酸探针的标记 （一）、标记物 —放射性同位素标记物 —非放射同位素标记物; 1.放射性同位素特点： ●放射自显影技术检测，信号的强弱通过 计数银粒的多少易于进行定量分析。主要缺点 射线对人体有伤害 放??性物质需特殊