荧光PCR检测麻风杆菌DNA与涂片抗酸染色结果的对照分析.docVIP

精品论文 参考文献 荧光PCR检测麻风杆菌DNA与涂片抗酸染色结果的对照分析 刘少刚1 郑华生2 林旸2 蔡銮端2 郑睦畅2 （1汕头大学医学院 广东汕头 515031) (2广东汕头市澄海区慢性病防治站 广东汕头 515800） 【摘要】目的 探讨荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA的拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度的相关性。方法 对5例现症麻风患者不同时期和16例多菌型治愈者的44份皮肤组织液样本，同时进行荧光定量PCR检测和做涂片抗酸染色镜检,按荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA结果的拷贝数和对应涂片抗酸染色镜检结果分为阴性(-)、1+、2+、3+、4+、5+、6+进行统计分析。结果 32份皮肤组织液涂片阴性样本中,4份样本荧光定量PCR检测阳性,麻风杆菌DNA拷贝数多为103数量级;12份涂片阳性样本中, 对应荧光定量PCR检测全部阳性,麻风杆菌DNA拷贝数多为104～105数量级,和涂片阳性程度基本呈正相关，荧光PCR检测阳性率比涂片抗酸染色高，但经统计学分析差异无显著性，（Pgt;0.05）。结论 荧光定量PCR检测麻风杆菌DNA拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度有较好的相关性,可以作为麻风病临床诊断和治疗的实验方法。 【关键词】麻风分枝杆菌 荧光定量PCR 抗酸染色 【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）13-0015-02 随着基因扩增技术的成熟和推广，荧光定量多聚酶链反应（FQ-PCR）检测病原体被广泛应用于医学各科，为了解荧光定量PCR检测麻风杆菌的情况，比较其拷贝数与传统常规的涂片抗酸染色镜检结果程度的相关性。我们于2010年3月至2012年5月，对汕头市澄海区的5例现症麻风病人的不同时期，以及16位已治愈的多菌型麻风治愈者共44份皮肤组织液样本同时进行荧光定量PCR检测和做涂片抗酸染色镜检,现报告如下。 1 资料和方法 1.1研究标本：44份皮肤组织液样本来源于5例麻风现症病人（4例为多菌型，1例为少菌型）的治疗前、治疗半年、治疗1年不同时期和16位多菌型麻风治愈者，取活动性皮损皮损组织液，或眶上、颧部、下颌和耳垂至少2个部位的皮肤组织液。 1.2标本的采集和处理：常规消毒皮肤，检查时戴消毒手套，用左手拇、食两指将患者皮肤捏紧提起，使局部皮肤变白??左手指不要松，然后右手持脱刀切开一个5毫米长，3毫米深的切口，以刀刃刮取组织液，粘于灭菌拭子放入密闭的离心管，冷藏做PCR检测麻风菌DNA用，同时刮取组织液涂在载玻片上，固定做抗酸染色用。 1.3荧光PCR检测麻风杆菌DNA：（1）仪器设备与拭剂 ：全自动基因扩增仪采用中山大学达安公司的DA7600，麻风杆菌核酸荧光PCR检测试剂盒是美国BioXL公司提供。（2）DNA的提取：按试剂盒的说明，加生理盐水1ml,充分混匀，10000rpm离心5分钟，弃上清。加50mu;l核酸提取液B，充分混匀。100℃处理10分钟，10000rpm离心5分钟，取上清液4mu;l做PCR反应。（3）PCR扩增:每个反应管加入26mu;l试剂（ML-PCR MIX 24mu;l+Taq酶系2mu;l），加入处理后DNA样本或阳性定量标准品梯度（使用前用阴性质控品将ML-阳性标准品（1times;107COPIES/ml）梯度希释10倍、100倍、1000倍，记为1times;106COPIES/ml，1times;105COPIES/ml，1times;104COPIES/ml）和阴性质控品4mu;l,10000rpm30秒。循环条件：93℃rarr;2分钟，后93℃5秒rarr;56℃45秒，共40个循环。（4）结果分析判定：保存数据，调节标准曲线至最佳，仪器自动分析计算出未知标本数值。 1.4涂片抗酸染色镜检：（1）染色：初染：滴加石碳酸复红溶液，小心加热5分钟。脱色：3%盐酸酒精脱色30秒至1分钟。复染：用碱性美兰溶液复染1分钟。（2）油镜观察：麻风杆菌呈红色，常聚集成堆，背景及非抗酸性细菌呈兰色。（3）报告：镜检按以下细菌密度计数。阴性（—）：在200个视野中未查到抗酸杆菌；（1+）：100个视野中有1～10个菌；（2+）：每10个视野中有1～10个菌；（3+）：平均每个视野中有1～10个菌；（4+）：平均每个视野中有10～100个菌；（5+）：平均每个视野有100～1000个菌；（6+）：每个视野中超过1000个菌或大量菌团。 1.5统计学分析：计数资料用chi;2检验进行通计分析，以Plt;0.05为差异显著。抗酸染色镜检结果程度与PCR检测麻风杆菌DNA拷贝数比较按每个程度对应的DNA拷贝数数量级进行分类分析。